Método para la detección de la Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria (HHT) que comprende el análisis in vitro de los productos de la expresión de los genes ENG o FLT1 Y ENG o ANGPT2 en muestras biológicas de pacientes y que,

además, permite sub-clasificar las variantes HHT1 y HHT2 de la enfermedad. En particular, la presente invención se refiere a un kit para la detección molecular de HHT capaz de llevar a cabo la detección mencionada anteriormente

Método de detección de la Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria.

La presente invención se refiere a un método para la detección de la Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria (HHT) que comprende el análisis in vitro de los productos de la expresión de los genes ENG o FLT1 y ENG o ANGPT2 en muestras biológicas de pacientes y que, además, permite sub-clasificar las variantes HHT1 y HHT2 de la enfermedad. En particular, la presente invención se refiere a un kit para la detección molecular de HHT capaz de llevar a cabo la detección mencionada anteriormente.

Estado de la técnica anterior

La Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria (HHT), también conocida como síndrome de Osler-Weber-Rendu es una enfermedad vascular autosómica dominante (Online Mendelian Inheritance in Man; OMIM 187300), asociada con frecuentes epistaxis, hemorragias gastrointestinales y cerebrales, telangiectasias, y malformaciones arteriovenosas en pulmón, hígado y cerebro (Guttmacher y col., 1995; Shovlin y Letarte, 1999). La penetrancia de la enfermedad varía con la edad, aumentando los síntomas de displasia conforme aumenta la edad del enfermo, siendo aproximadamente del 90% a los 45 años. Las telangiectasias de los pacientes de HHT muestran un ensanchamiento de las vénulas postcapilares, desapareciendo eventualmente la red capilar, y estableciéndose, por tanto, una conexión directa entre arteriolas y vénulas. Los estudios más recientes indican que la prevalencia media de la HHT se halla en torno a 1/5.000-1/8.000, siendo mayor en ciertas regiones como la isla de Funen en Dinamarca, la región de Jura en Francia, o la isla de Bonaire en las Antillas holandesas (Kjeldsen y col., 1999; Plauchu y col., 1989; Shovlin y Letarte, 1999). Esta enfermedad se produce por mutaciones en heterocigosis en al menos 4 loci. Los primeros loci en ser identificados fueron endoglina (ENG), situado en el cromosoma 9 (McAllister y col., 1994) y ALK1, situado en el cromosoma 12 (Johnson y col., 1996), dando lugar a las HHT tipo 1 y 2 respectivamente. En torno a un 90% de los enfermos de HHT presentan una mutación en uno de estos dos genes. Los síntomas clínicos de las variantes HHT1 y HHT2 son muy parecidos, pero su correcto diagnóstico es importante en la elección del screening y seguimiento. La prevalencia de la HHT1 sobre la HHT2 es mayor en Canadá, USA y Norte de Europa; además, en esta variante la edad de comienzo de la enfermedad es más temprana y las malformaciones arteriovenosas en pulmón aparecen con mayor frecuencia que en la HHT2. En cambio, el sangrado gastrointestinal y la afectación hepática son más frecuentes en la variante HHT2 que en la HHT1 (Berg y col., 2003, Abdalla y Letarte, 2006; Letteboer y col. 2006). Además la HHT2 es más frecuente que la HHT1 en los países mediterráneos (España, Francia e Italia). Recientemente se han descrito un tercer y cuarto locus situados en los cromosomas 5 (Colé y col., 2005) y 7 (Bayrak-Toydemir y col., 2006) que serían responsables de la HHT3 y HHT4 respectivamente, aunque los genes afectados aún se desconocen.

Tanto endoglina como ALK1 son proteínas que se expresan fundamentalmente en células endoteliales (Bourdeau y col., 1999; Oh y col., 2000) y su expresión se ha visto aumentada en estas células en zonas donde se está produciendo una angiogénesis activa (Duff y col., 2003, Fonsatti y col., 2003, Goumans y col., 2003). Debido a su implicación en el desarrollo cardiovascular, los ratones knock out, tanto de Eng como de Alk1, mueren en el proceso de gestación (Li y col., 1999, Oh y col., 2000). Endoglina y ALK1 forman parte del complejo receptor de TGF-beta, que pertenece a una superfamilia de citoquinas relacionadas capaces de regular una multitud de procesos celulares como proliferación, diferenciación, motilidad, adhesión y muerte celular (Massagué, 1990; Shi y Massague, 2003). La familia de TGF-beta controla y regula la homeostasis, desarrollo y reparación de los distintos tejidos del organismo. Uno de los procesos fundamentales regulados por TGF-beta es la angiogénesis (Pepper, 1997). La angiogénesis supone la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de otros preexistentes. Este proceso es fundamental en embriogénesis, cicatrización de heridas, crecimiento de tumores y patologías inflamatorias (Risau, 1997). Endoglina juega un importante papel en la angiogénesis (Duff y col., 2003; Jerkic y col., 2006a) y es precisamente en estos procesos fisiopatologicos donde se han detectado altos niveles de expresión de endoglina (Fonsatti y col., 2003; Duff y col., 2003). Endoglina también regula la homeostasis vascular (Jerkic y col., 2004; Toporsian y col., 2005; Jerkic y col., 2006b) y en este contexto, recientemente, se ha descrito un papel funcional para una forma soluble de endoglina (sEng) presente en pacientes embarazadas con preeclampsia (Levine y col., 2006, Luft, 2006, Venkatesha y col., 2006, Lopez-Novoa, 2007, Lim y col, 2008). Niveles elevados en suero del receptor del factor de crecimiento epidérmico 1 (VEGF-R1/sFlt1) y de sEng se han encontrado en mujeres con preclampsia (Levine y col., 2006, Lim y col., 2008).

Angiopoiteina-2 (Ang-2) es otro factor soluble en el plasma implicado en angiogénesis y preeclampsia (Hirokoshi y col, 2007; Shim y col, 2007). El hecho de que los niveles de expresión de Ang-2 en pacientes con HHT se encuentren disminuidos aproximadamente a la mitad con respecto a los niveles en donantes sanos indica una potencial relevancia funcional de este factor en HHT (Fernandez-L, 2007).

Actualmente, para la detección de HHT se suele emplear un perfil clínico consensuado que se conoce como el criterio de Curaçao, desarrollado por el Comité consultivo científico de la Fundación de la HHT (Shovlin y col, 2000). Este criterio incluye cuatro rasgos: epistaxis (sangrados espontáneos de las fosas nasales); telangiectasias (en sitios característicos, tales como los labios, la cavidad bucal, los dedos, y la nariz); malformaciones arteriovenosas en órganos internos (AVMs en pulmón, en cerebro, en hígado o en la médula espinal); y antecedentes familiares. La diagnosis de HHT se establece, si tres de estos criterios están presentes. Si se cumplen uno o dos criterios, se recomienda la determinación de la mutación genética. Sin embargo, la disposición de un servicio de diagnóstico basado en la secuenciación es controvertida por el predominio de mutaciones nuevas en individuos afectados (al menos en ENG y ALK1) y de dificultades en la detección de mutaciones en heterocigosis, especialmente cuando un solo cambio en una base permite la detección de la enfermedad.

Explicación de la invención

La presente invención, basada en la detección de niveles de algunos componentes solubles en muestras de sangre es una herramienta útil para diagnosticar de manera sencilla, rápida y eficaz la HHT y discriminar entre sus formas HHT1 y HHT2.

Dicho método comprende la obtención de una muestra de sangre de sujetos susceptibles de padecer HHT, la detección de los componentes solubles del plasma sEng y sFlt1 o sEng y Ang-2 en dicha muestra, y la comparación de la cantidad detectada de dichos componentes solubles con una cantidad de referencia observada en un grupo control de individuos sanos.

Como consecuencia de este análisis, los investigadores pudieron determinar que los niveles de sEng, sFlt1 y Ang-2 se encuentran disminuidos significativamente en pacientes con HHT con respecto al grupo control. Además, los niveles de sEng y Ang-2 presentan diferencias significativas entre los pacientes con las formas de la enfermedad HHT1 y HHT2.

Mediante un análisis discriminante usando como variables sEng, sFlt1 y Ang-2, los investigadores fueron capaces de realizar una detección diagnóstica de HHT en sujetos donde la mutación en ENG o ALK1 había sido identificada, pudiendo analizar el comportamiento de sEng y Ang-2 en el plasma de ambos subtipos de HHT En primer lugar, niveles reducidos de sEng y de sFlt1 permitieron establecer la condición "enfermo de HHT" con una probabilidad del 95%. Para distinguir entre las variantes HHT1 y HHT2, los investigadores consideraron en el análisis discriminante los niveles de expresión de sEng y Ang-2, pudiendo discriminar entre las condiciones "enfermo de HHT1" o "enfermo de HHT2" con una probabilidad del 80%.

Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método para la detección de Telangiectasia Hereditaria Hemorrágica (HHT) que comprende:

1. Método para la detección de Telangiectasia Hereditaria Hemorrágica (HHT) que comprende: