Anticuerpos humanizados contra la molécula de adhesión leucocitaria VLA-4.

Inmunoglobulina humanizada para su utilización en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria del sistemanervioso central,

que comprende una cadena pesada humanizada y una cadena ligera humanizada:

(1) comprendiendo la cadena ligera humanizada tres regiones que determinan la complementariedad, (CDR1,CDR2 y CDR3), que tienen secuencias de aminoácidos de las correspondientes regiones que determinan lacomplementariedad, de una cadena ligera inmunoglobulínica 21-6 de ratón, de SEC ID nº: 2, (como semuestra en la Figura 1), y un armazón de región variable procedente de una secuencia de armazón de regiónvariable de cadena ligera kappa humana, excepto en al menos una posición seleccionada de entre un primergrupo que consiste en L45, L49, L58 y L69, en la que la posición del aminoácido está ocupada por el mismoaminoácido presente en la posición equivalente del armazón de la región variable de cadena ligerainmunoglobulínica 21.6 de ratón; y

(2) comprendiendo la cadena pesada humanizada tres regiones que determinan la complementariedad, (CDR1,CDR2 y CDR3), que tienen secuencias de aminoácidos procedentes de las regiones correspondientes quedeterminan la complementariedad de una cadena pesada inmunoglobulínica 21.6 de ratón, de SEC ID nº: 4,(como se muestra en la Figura 2), y un armazón de región variable procedente de una secuencia de armazónde región variable de cadena pesada humana, excepto en al menos una posición seleccionada de entre ungrupo que consiste en H27, H28, H29, H30, H44, H71, en la que la posición del aminoácido está ocupada porel mismo aminoácido presente en la posición equivalente del armazón de la región variable de cadenapesada inmunoglobulínica 21.6 de ratón;

en la que la inmunoglobulina se une específicamente a un ligando VLA-4 con una afinidad de unión que tiene unlímite inferior de 107 M-1 25 y un límite superior de cinco veces la afinidad de unión de la inmunoglobulina 21.6 de ratónque tiene la cadena ligera de SEC ID nº: 2 y la cadena pesada de SEC ID nº: 4.

Anticuerpos humanizados contra la molécula de adhesión leucocitaria VLA-4.

Campo técnico

La presente invención se refiere generalmente a anticuerpos humanizados específicos para la subunidad α-a de la molécula de adhesión leucocitaria VLA-4.

Antecedentes de la invención La inflamación es una respuesta de los tejidos vascularizados a la infección o la lesión, y se efectúa mediante lesión de leucocitos a las células endoteliales de los vasos sanguíneos y su infiltración en los tejidos circundantes. En la inflamación normal, los leucocitos que se infiltran liberan mediadores tóxicos para exterminar a los organismos invasores, fagocitar los desechos y células muertas, y desempeñan un papel en la reparación tisular y a la respuesta inmunitaria. Sin embargo, en la inflamación patológica, los leucocitos infiltrantes son muy reactivos y pueden provocar un daño grave o mortal. Véase, por ejemplo, Kickey, Psychoneuroimmunology II (Academia Press 1990) .

La unión de los leucocitos a las células endoteliales se efectúa vía una interacción específica de los ligandos y receptores de la superficie celular, sobre las células endoteliales, y los leucocitos. Véase, generalmente, Springer, Nature 346:425-433 (1990) . La identidad de los ligandos y receptores varía para diferentes subtipos celulares, localizaciones anatómicas y estímulos inflamatorios. El receptor de superficie celular leucocitario VLA-4 se identificó en primer lugar por Hemler, documento EP 330.506 (1989) (incorporado en su totalidad como referencia a todos los efectos) . VLA-4 es un miembro de la familia de β1 integrinas de receptores de la superficie celular, cada uno de los cuales comprende cadenas α y β. VLA-4 contiene una cadena α4 y una cadena β1. VLA-4 se une específicamente a un ligando de células endoteliales denominado VCAM-1. Véase Elices et al., Cell 60:577-584 (1990) (incorporado en su totalidad como referencia a todos los efectos) . Aunque el VLA-4 se detecto en primer lugar sobre células activadas de la vena umbilical humana, este ligando también se ha detectado en células endoteliales cerebrales. Véase la Solicitud, del mismo solicitante y en trámite junto con la presente, US serie nº 07/871.223 (incorporada en su totalidad como referencia a todos los efectos) .

Las moléculas de adhesión, tales como UVLA-4, son dianas potenciales para agentes terapéuticos. El receptor de VLA-4 es una diana particularmente importante debido a su interacción con un ligando que reside en las células endoteliales cerebrales. Las enfermedades y patologías que resultan de la inflamación cerebral tiene secuencias particularmente graves, por ejemplo, una de tales enfermedades, las esclerosis múltiples (MS) , tiene una evolución crónica (con o sin exacerbación y remisiones) , conduciendo a una discapacidad grave y a la muerte. La enfermedad afecta a una población estimada de 250.000 hasta 350.000 sólo en los estados unidos de América.

Los anticuerpos frente al receptor de VLA-4 se han ensayado para determinar su potencial antiinflamatorio tanto en modelos de animales in vitro como in vivo. Véase USSN 07/871.223 y Yednock et al., Nature 356:63-66 (1992) (incorporado en su totalidad como referencia a todos los efectos) . Los experimentos in vitro demuestran que los anticuerpos anti-VLA-4 bloquean la unión de los linfocitos a células endoteliales cerebrales. Los experimentos animales estudian el efecto de los anticuerpos anti-VLA-4 sobre animales que tienen una patología inducida artificialmente (encefalomielitis autoinmunitaria experimental) , que simula la esclerosis múltiple. Los experimentos muestran que la administración de anticuerpos anti-VLA-4 evitan la inflamación del cerebro y la parálisis subsiguiente en los animales. De forma colectiva estos experimentos identifican anticuerpos anti-VLA-4 como agentes terapéuticos potencialmente útiles para tratar esclerosis múltiple y otras enfermedades y trastornos inflamatorios.

Un problema significativo con los anticuerpos anti-VLA-4 disponible hasta la fecha es que son todos de origen murino, y por lo tanto tienen la probabilidad de provocar una respuesta anti-ratón humana (HAMA) en el uso clínico. Una respuesta HAMA reduce la eficacia de los anticuerpos de ratón en pacientes, y evita la administración continuada. Un enfoque a este problema es humanizar anticuerpos de ratón, en este enfoque, las regiones que determinas la complementariedad (CDR) y otros ciertos aminoácidos de regiones variables de un ratón donante se injertan en regiones aceptoras variables humanas, y se unen a regiones constantes humanas. Véase, por ejemplo, Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1998) ; Winter, documento US 5.225.539 (1993) (cada uno de los cuales está incorporado en su totalidad como referencia a todos los efectos) .

Aunque se han producido varios ejemplos de anticuerpos humanizados, la transición de un anticuerpo murino a un anticuerpo humanizado implica un compromiso de consideraciones que compiten entre sí, cuya solución varía con diferentes anticuerpos. Para minimizar la inmunogenecidad, la inmunoglobulina debe retener tanta secuencia aceptora humana como sea posible. Sin embargo, para retener propiedades de unión auténticas, la estructura de la inmunoglobulina debe contener suficiente sustituciones de la secuencia aceptora humana como para asegurar una conformación tridimensional de las regiones de CDR tan parecida como sea posible a aquella y la inmunoglobulina original del donante murino. Como resultado de estas consideraciones que compiten entre sí, muchos anticuerpos humanizados producidos hasta la fecha muestran alguna pérpdida de afinidad de unión en comparación con los anticuerpos murinos correspondientes de los que derivan. Véase, por ejemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986) ; Shearman et al., J. Immunol. 147:4366-4373 (1991) ; Kettleborough et al., Protein Engineering 4: 773-783 (1991) ; Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185 (1991) ; Tempest et al., Biotechnology 9:266-271 (1991) .

Basándose en lo anterior, está claro que existe una necesidad de anticuerpos anti-VLA-4 humanizados que demuestren una fuerte afinidad por el receptor de VLA-4, a la vez que muestren poca, o ninguna, respuesta antiratón humana. La presente invención satisface esta y otras necesidades.

Sumario de la invención La invención proporciona inmunoglobulinas humanizadas que se unen específicamente a un VLA-4. Los anticuerpos humanizados comprenden una cadena ligera humanizada y una cadena pesada humanizada. La cadena ligera humanizada comprende tres regiones que determinan la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) , que tienen secuencias de aminoácidos procedentes de las regiones correspondientes que determinan la complementariedad de una cadena ligera inmunoglobulínica 21-6 de ratón, de SEC ID nº: 2 (como se muestra en la Figura 1) , y un armazón de región variable procedente de una secuencia de armazón de región variable de cadena ligera kappa humana, excepto en al menos una posición seleccionada de un primer grupo que consiste en las posiciones L45, L49, L58 y L69, en la que la posición del aminoácido está ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente del armazón de la región variable de cadena ligera inmunoglobulínica 21.6 de ratón. La cadena pesada humanizada comprende tres regiones que determinan la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen secuencias de aminoácidos procedentes de las regiones correspondientes que determinan la complementariedad de una cadena pesada inmunoglobulínica 21-6 de ratón, de SEC ID nº: 4 (como se muestra en la Figura 2) , y un armazón de región variable procedente de una secuencia de armazón de región variable de cadena pesada humana, excepto en al menos una posición seleccionada de un grupo que consiste en H27, H28, H29, H30, H44, H71, en la que la posición del aminoácido está ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente del armazón de la región variable de cadena pesada inmunoglobulínica 21-6 de ratón. Las inmunoglobulinas se unen específicamente a VLA-4 con una afinidad que tiene un límite inferior de 107 M-1 y un límite superior de cinco veces la afinidad de la inmunoglobulina 21-6 de ratón que tiene la cadena ligera de SEC nº: 2 y la cadena pesada de SEC ID nº: 4.

Habitualmente, los armazones de región variable de cadena ligera y de cadena pesada humanizada proceden de las secuencias del armazón de la región variable de RE1 y 21/28’CL, respectivamente. Cuando el armazón de la región variable de cadena ligera humanizada procede de RE1, al menos se reemplazan dos aminoácidos del armazón. Un aminoácido procede del primer grupo de posiciones descritas más arriba. Los otros aminoácidos... [Seguir leyendo]

1. Inmunoglobulina humanizada para su utilización en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria del sistema nervioso central, que comprende una cadena pesada humanizada y una cadena ligera humanizada: 5

(1) comprendiendo la cadena ligera humanizada tres regiones que determinan la complementariedad, (CDR1, CDR2 y CDR3) , que tienen secuencias de aminoácidos de las correspondientes regiones que determinan la complementariedad, de una cadena ligera inmunoglobulínic.

2. 6 de ratón, de SEC ID nº: 2, (como se muestra en la Figura 1) , y un armazón de región variable procedente de una secuencia de armazón de región variable de cadena ligera kappa humana, excepto en al menos una posición seleccionada de entre un primer grupo que consiste en L45, L49, L58 y L69, en la que la posición del aminoácido está ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente del armazón de la región variable de cadena ligera inmunoglobulínica 21.6 de ratón; y

(2) comprendiendo la cadena pesada humanizada tres regiones que determinan la complementariedad, (CDR1, CDR2 y CDR3) , que tienen secuencias de aminoácidos procedentes de las regiones correspondientes que determinan la complementariedad de una cadena pesada inmunoglobulínica 21.6 de ratón, de SEC ID nº: 4, (como se muestra en la Figura 2) , y un armazón de región variable procedente de una secuencia de armazón de región variable de cadena pesada humana, excepto en al menos una posición seleccionada de entre un grupo que consiste en H27, H28, H29, H30, H44, H71, en la que la posición del aminoácido está ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente del armazón de la región variable de cadena pesada inmunoglobulínica 21.6 de ratón;

en la que la inmunoglobulina se une específicamente a un ligando VLA-4 con una afinidad de unión que tiene un límite inferior de 107 M-1 y un límite superior de cinco veces la afinidad de unión de la inmunoglobulina 21.6 de ratón que tiene la cadena ligera de SEC ID nº: 2 y la cadena pesada de SEC ID nº: 4.

2. Inmunoglobulina humanizada para su utilización según la reivindicación 1, en la que el armazón de región variable de cadena ligera humanizada procede de una secuencia de armazón de la región variable de RE1, excepto en al menos una posición seleccionada de entre el primer grupo, y excepto en al menos una posición seleccionada de entre un tercer grupo que consiste en las posiciones L104, L105 y L107, en la que la posición del aminoácido está ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente de una cadena ligera kappa de una inmunoglobulina humana distinta de RE1.

3. Inmunoglobulina humanizada para su utilización según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el armazón de región variable de cadena pesada humanizada procede de una secuencia de armazón de la región variable de 21/28’CL.

4. Inmunoglobulina humanizada para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el

armazón de región variable de cadena ligera humanizada comprende al menos tres aminoácidos de la inmunoglobulina 21.6 de ratón en las posiciones en el primer grupo, y tres aminoácidos de la cadena ligera kappa de la inmunoglobulina humana distinta de RE1, en las posiciones en el tercer grupo, y el armazón de región variable de cadena pesada humanizada comprende al menos cinco aminoácidos procedentes de la inmunoglobulina 21.6 de ratón, en las posiciones en el segundo grupo.

5. Inmunoglobulina humanizada para su utilización según la reivindicación 4, en la que el armazón de región variable de cadena ligera humanizada es idéntico a la secuencia del armazón de región variable de cadena ligera RE1, excepto por al menos las tres posiciones del primer grupo, y las tres posiciones del tercer grupo, y el armazón de región variable de cadena pesada es idéntico a la secuencia de armazón de la región variable de cadena pesada 50 de 21/28’CL, excepto para al menos las cinco posiciones del segundo grupo.

6. Inmunoglobulina humanizada para su utilización según la reivindicación 5, en la que al menos las tres posiciones del primer grupo son posiciones L45, L58 y L69, y al menos cinco posiciones del segundo grupo son las posiciones H27, H28, H29, H30 y H71.

7. Inmunoglobulina humanizada para su utilización según la reivindicación 6, en la que la cadena ligera humanizada comprende regiones que determinan la complementariedad, que son idénticas a las correspondientes regiones que determinan la complementariedad de la cadena pesada de 21.6 de ratón, y la cadena pesada humanizada comprende regiones que determinan la complementariedad, que son idénticas a las correspondientes regiones que 60 determinan la complementariedad de la cadena pesada de 21.6 de ratón, excepto que la región CDR3 de la cadena pesada humanizada puede comprender o no un resto de fenilalanina en la posición H98.

8. Inmunoglobulina humanizada para su utilización según la reivindicación 7, en la que la CDR3 de la cadena pesada humanizada comprende una fenilalanina en la posición H98. 65

9. Inmunoglobulina humanizada para su utilización según la reivindicación 1, en la que la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera madura es la secuencia denominada La (SEC ID nº:7) en la Figura 6, o la secuencia denominada Lb (SEC ID nº: 8) en la Figura 6.

10. Inmunoglobulina humanizada para su utilización según la reivindicación 1 o reivindicación 9, en la que la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada madura se selecciona de: Ha (SEC ID nº:11) , Hb (SEC ID nº:12) o Hc (SEC ID nº:13) , según se muestra en la Figura 7.

11. Inmunoglobulina humanizada para su utilización según la reivindicación 10, que tiene un dominio de región constante, teniendo el dominio de región constante una función efectora, o careciendo de una función efectora, preferiblemente siendo capaz dicha función efectora de la fijación al complemento o de la toxicidad celular dependiente del anticuerpo.