SINTESIS DE PEPTIDOS T-20 USANDO FRAGMENTOS PEPTIDICOS INTERMEDIOS.

Un método para preparar un péptido que tiene la secuencia Ac-YTSLIHSLIEEQNQQEKNEQELLELDK WASLWNWF-NH2 (SEQ ID NO:

1) que comprende las etapas de:

(a) aporte de una resina soporte de síntesis en fase sólida de fórmula Z-E-(SUP), en la que la (SUP) es la resina soporte, E es un residuo de ácido glutámico, y Z es el grupo protector del extremo NH2, y donde Z-E está presente en (SUP) en un factor de carga de 0,5 o menos;

(b) acoplar aminoácidos a Z-E-(SUP) para lograr el Z-YTSLIHSLIEESQNQQE-(SUP);

(c) tratar Z-YTSLIHSLIEESQNQQE-(SUP)para conseguir el producto de escisión Ac-YTSLIHSLIEESQNQ QE (SEQ ID NO:2); y (d) utilizar Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE-OH(SEQ ID NO:2) para la síntesis de Ac-YTSLIHSLIEEQNQQEK NEQELLELDKW ASLWNWF-NH2 (SEQ ID NO:1)

Síntesis de péptidos T-20 usando fragmentos peptídicos intermedios.

La presente invención se refiere a métodos para preparar péptidos T-20 usando procesos en fase sólida y en solución además de fragmentos peptídicos intermedios T-20 que se pueden utilizar en estos métodos. Más en particular, la invención se refiere a la preparación de péptidos T-20 usando dos fragmentos que son sintetizados usando un método de fase sólida.

Muchos métodos para la síntesis de péptidos se han descrito en la literatura (por ejemplo, ver patente americana nº 6.015.881; Mergler y cols. (1988) Tetrahedron Letters 29: 4005-4008; Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29: 4009-4012; Kamber et al. (eds), Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden (1992) 525-526; Riniker y cols. (1993) Tetrahedron Letters 49: 9307-9320; Lloyd-Williams y cols. (1993) Tetrahedron Letters 49: 11065-11133; y Andersson y cols. (2000) Biopolymers 55: 227-250. Los diversos métodos de síntesis se distinguen por el estado físico de la fase en la cual tiene lugar la síntesis, es decir la fase líquida o la fase sólida.

En la síntesis de péptidos (SPPS) en fase sólida, un grupo aminoácido o peptídico se une a una resina soporte sólida. Luego, sucesivos grupos de aminoácidos o péptidos se acoplan al péptido unido al soporte hasta que se forma el material peptídico de interés. El péptido unido al soporte es posteriormente separado del mismo y sometido a un tratamiento y/o purificación adicionales. En algunos casos, la síntesis en fase sólida da lugar a un producto peptídico maduro; en otros casos, el péptido separado del soporte (es decir, un "fragmento de producto peptídico intermedio") se utiliza en la preparación de un producto peptídico maduro, más grande.

Los fragmentos intermedios peptídicos generados en los procesos en fase sólida se pueden acoplar juntos en un proceso sintético en fase líquida (al que aquí se hace referencia como "síntesis en solución"). La síntesis en solución puede ser especialmente útil en los casos en los que la síntesis de un péptido maduro útil en fase sólida es imposible o no práctica. Por ejemplo, en la síntesis en fase sólida, los péptidos más largos pueden adoptar eventualmente una conformación irregular mientras se mantienen unidos al soporte sólido, lo que conduce a una pérdida total o parcial de la actividad en el producto final. Es decir, a medida que la cadena de péptidos se hace más larga en la resina soporte, la eficacia de las etapas del proceso como el acoplamiento y la desprotección pueden verse comprometidas. Esto, en cambio, puede dar lugar a tiempos de tratamiento más largos para compensar estos problemas, junto con unas pérdidas crecientes en los materiales de partida, como los aminoácidos activables, los co-reactivos y los disolventes. Estos problemas pueden aumentar a medida que la longitud del péptido aumenta, y por lo tanto, es relativamente poco frecuente hallar péptidos maduros de más de 30 aminoácidos de longitud sintetizados usando solamente un procedimiento en fase sólida.

En el acoplamiento en solución, dos fragmentos peptídicos intermedios o bien un fragmento intermedio peptídico y un aminoácido reactivo se acoplan en un disolvente apropiado, y generalmente en presencia de reactivos adicionales que promueven la eficacia y la calidad de la reacción de acoplamiento. Los fragmentos peptídicos intermedios se disponen de manera que el grupo terminal N de un fragmento se acopla al grupo terminal C de otro fragmento, o viceversa. Además, los grupos protectores de la cadena lateral que están presentes durante la síntesis en fase sólida son retenidos frecuentemente en los fragmentos durante el acoplamiento de la fase en solución para garantizar la reactividad específica de los extremos terminales de los fragmentos. Estos grupos protectores de las cadenas laterales habitualmente no se eliminan hasta que se ha formado un péptido maduro.

Para la síntesis de péptidos muy grandes, es frecuente que se lleven a cabo múltiples etapas de acoplamiento en la fase en solución utilizando tres o cuatro o más fragmentos intermedios peptídicos. Mientras que el concepto general de las reacciones de acoplamiento extremo a extremo en las reacciones en solución es en general teóricamente sencillo cuando se utilizan múltiples fragmentos peptídicos intermedios, en la práctica esto no suele ser así. Diversos factores, como las impurezas y el rendimiento peptídico, pueden tener un efecto significativo en la calidad y el rendimiento de un péptido de longitud completa. Por lo tanto, la síntesis peptídica que utiliza esquemas híbridos a menudo da que pensar, y en muchos casos, es difícil de predecir que problemas son inherentes en un esquema de síntesis hasta que se lleva a cabo la verdadera síntesis.

En algunos casos, la síntesis en solución puede verse afectada por una falta de pureza de los fragmentos intermedios peptídicos posterior a la síntesis en fase sólida. A este respecto, puede ser necesario someter los fragmentos intermedios peptídicos a una etapa de purificación previa al acoplamiento de los fragmentos en un proceso en solución. La purificación, en cambio, puede causar una reducción en el rendimiento de los fragmentos intermedios peptídicos, y de acuerdo con ello, en el producto peptídico final.

Es decir, el rendimiento del péptido maduro es inversamente proporcional al número de etapas en solución que se requieren para sintetizar el péptido maduro. En algunos casos, se requieren tres, cuatro o más de cuatro etapas en solución que utilizan productos peptídicos intermedios para generar un péptido maduro. Cada etapa de acoplamiento adicional de la fase en solución puede dar lugar a una devolución reducida del producto peptídico de longitud completa. Por lo tanto, para mejorar el rendimiento global, en general se desea minimizar las etapas implicadas en el acoplamiento.

Ligeras mejorías en una o más etapas en el esquema global sintético pueden dar lugar a una mejoría significativa en la preparación de péptidos maduros. Dichas mejorías podrán significar un ahorro global en tiempo y reactivos e incluso la mejora de la pureza y el rendimiento del producto final.

Mientras que la discusión sobre la importancia de las mejoras en la síntesis híbrida se puede aplicar a cualquier tipo de péptidos fabricados usando estos procedimientos, tiene una importancia especial en el contexto de los péptidos que son útiles desde el punto de vista terapéutico y que se fabrican a una escala para el uso médico comercial. Mientras que la síntesis de fármacos de moléculas pequeñas puede ser relativamente barata, el coste de la síntesis de fármacos compuestos por biomoléculas más grandes, como los péptidos terapéuticos, puede ser mucho mayor. Debido al coste de los reactivos y al tiempo de síntesis, además de otros factores, los escasos avances en el proceso sintético de estos fármacos compuestos por biomoléculas pueden tener un impacto significativo sobre si es factible o no fabricar dicho fármaco. Dichas mejoras o avances se deben necesariamente a los elevados costes de producción y todo ello viene respaldado por el hecho de que en muchos casos existen pocas o casi ninguna alterativa terapéutica adecuada para estos tipos de fármacos de biomoléculas grandes.

Esto se puede ver claramente en el caso de péptidos terapéuticos que se utilizan para el tratamiento de enfermedades de inmunodeficiencia causadas por la inyección retrovírica. Los péptidos que tienen actividad antirretrovírica pueden actuar de diferente modo, lo que incluye el impedir la fusión de la partícula vírica con la célula inmunitaria huésped. Existe una gran necesidad de estos péptidos terapéuticos nuevos y eficaces porque, en muchos casos, los antivíricos utilizados tradicionalmente son ineficaces para el tratamiento de estas enfermedades debido a la resistencia vírica por mutación.

Una clase prometedora de péptidos terapéuticos útiles para combatir las enfermedades de inmunodeficiencia son los inhibidores de la fusión. Este tipo de péptidos terapéuticos puede reducir el valor vírico, y mejorar de forma significativa la calidad de vida en pacientes que tienen enfermedades de inmunodeficiencia. Por ejemplo, el péptido FUZEON® (también conocido como enfuvirtida o T-20), que es un péptido sintético, de 36 aminoácidos, el péptido híbrido T-1249, y los derivados y los homólogos de estos péptidos han demostrado ser buenos como inhibidores de la fusión en el tratamiento del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). El péptido...

1. Un método para preparar un péptido que tiene la secuencia Ac-YTSLIHSLIEEQNQQEKNEQELLELDK WASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO:1) que comprende las etapas de: