Un epítope de célula asistente T seleccionado del grupo caracterizado porque consiste de SEC. DE IDENT. NO: 6 o 15

Epítopos artificiales de células T ayudadoras como estimuladores inmunes para péptidos sintéticos inmunógenos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un inmunógeno peptídico que comprende un epítope novedoso artificial de célula asistente T (Th) unido covalentemente a un sitio objetivo antigénico deseado que comprende epítopes de células B y opcionalmente una secuencia general inmuno estimuladora. El epítope artificial Th imparte al inmunógeno peptídico la capacidad de inducir respuestas inmunes fuertes mediadas por células asistentes T y la producción de anticuerpos dirigidos en contra de "el sitio objetivo antigénico". La invención también proporciona el reemplazo ventajoso de proteínas portadoras y sitios de células asistentes T derivados de patógeno en inmunógenos peptídicos establecidos por los epítopes novedosos artificiales de células asistentes T para mejorada inmunogenicidad.

Se han desarrollado muchas reglas para predecir las secuencias de aminoácidos de los epítopes de las células T. Sin embargo, debido a que no existe una teoría unificante central sobre como o que hace a una secuencia de aminoácidos particular útil como epítope de células T, las reglas son empíricas y no son universalmente aplicables. Estando enterados de estás reglas, se desarrollaron los epítopes novedosos artificiales de células asistentes T de la presente invención, sin embargo, por investigación empírica.

Los inmunógenos peptídicos de la presente invención son útiles para evocar respuestas anticuerpo en un huésped inmunizado a un sitio objetivo antigénico deseado, que incluye sitios tomados de organismos patogénicos y sitios tomados de autoantígeno normalmente inmuno silenciosos y objetivos asociados con tumores. En consecuencia, los péptidos de la invención son útiles en diversas aplicaciones médicas y veterinarias, tales como: vacunas para proporcionar inmunidad protectora de enfermedades infecciosas; inmunoterapias para tratar trastornos que resultan del mal funcionamiento de los procesos fisiológicos normales; inmunoterapias para tratar cáncer y como agentes para intervenir en procesos fisiológicos normales para producir resultados deseables.

Por ejemplo, los epítopes novedosos artificiales de células asistentes T de la presente invención proporcionan inmunógenos peptídicos cortos novedosos que producen anticuerpos seleccionados para la hormona que libera la hormona luteinizante (LHRH) y son útiles para anticoncepción, control de tumores dependientes de hormona, prevención de mancha de puerco sin castrar, e inmunocastración. Los epítopes novedosos artificiales de Th de la presente invención se han encontrado que provocan una respuesta inmune cuando se combinan con epítopes de células B objetivo de diversos microorganismos/proteínas/ péptidos. Además de la LHRH, los epítopes artificiales de Th de la presente invención se ha encontrado que son útiles cuando se enlazan a otros sitios antigénicos objetivo que incluyen somatostatina para la promoción del crecimiento en animales de granja; IgE para el tratamiento de alergia; el receptor CD4 de las células asistentes T para el tratamiento y prevención de la infección por VIH y trastornos inmunes; y proteína de capsida del virus de la enfermedad de pie y boca para la prevención de la enfermedad de pie y boca; epítopes virion VIH para la prevención y tratamiento de la infección VIH; el antígeno de circunesporozoito de Plasmodium falciparum para la prevención y tratamiento de arteriosclerosis.

Antecedentes de la invención

Se sabe que la mayoría de las respuestas inmunes del anticuerpo son mediadas por células, que requieren la interacción cooperativa entre células que presentan antígeno, células B (células que producen anticuerpos las cuales también funcionan como células que presentan antígenos), y células asistentes T (Th). Consecuentemente, la producción de una respuesta del anticuerpo efectiva requiere que las células B reconozcan el sitio antigénico objetivo (epítope de células B) de un sujeto inmunógeno y que las células asistentes T reconozcan un epítope de Th. Generalmente, el epítope de asistentes T sobre un sujeto inmunógeno es diferente de su epítope o epítopes de células B (Babbitt et al., Nature, 1985; 317:359-361). El epítope de células B es un sitio sobre el objetivo deseado reconocido por las células B las cuales en respuestas producen anticuerpos hacia el sitio objetivo deseado. Se entiende que la conformación natural del objetivo determina el sitio al cual se enlaza el anticuerpo directamente. El reconocimiento de proteínas por las células asistentes T es, sin embargo, mucho más complejo y menos bien entendido. (Cornette et al., Methods in Enzymology, vol 178, Academic Press, 1989, pp 611-634).

Bajo las teorías presentes, la evocación de una respuesta de células Th requiere que el receptor de las células asistentes T reconozca no el objetivo deseado si no un complejo sobre la membrana de la célula que presenta el antígeno formado entre un fragmento peptídico procesado de la proteína objetivo y un complejo de histocompatibilidad principal clase II asociado (MHC). Así, el procesamiento peptídico de la proteína objetivo y un reconocimiento de tres formas se requiere para la respuesta de la célula asistente T. El complejo de tres partes es particularmente difícil de definir puesto que los residuos de contacto MHC clase II críticos se ubican variablemente dentro de diferentes péptidos de enlace MHC (epítopes Th) y estos péptidos son de longitudes variables con diferentes secuencias de aminoácidos (Rudensky et al., Nature, 1991; 353:622-627). Además, las moléculas de MHC clase II en si mismas son altamente diversas dependiendo del carácter genético del huésped. La inmuno responsividad a un epítope Th particular se determina de esta forma en parte por los genes MHC del huésped. De hecho, se ha demostrado que ciertos péptidos solamente se enlazan a los productos de alelos MHC clase II particulares. Así, es difícil identificar epítopes Th promiscuos, es decir, aquellos que son reactivos a través de las especies y a través de los individuos de una especie sencilla. Se ha encontrado que la reactividad de los epítopes Th es diferente aún entre individuos de una población.

Los múltiples y variados factores para cada una de las etapas componentes del reconocimiento de células T: el procesamiento peptídico apropiado por la célula que procesa el antígeno, la presentación del péptido por una molécula MHC clase II genéticamente determinada y el reconocimiento del complejo molecular de MHC/péptido por el receptor sobre las células asistentes T ha hecho difícil determinar los requerimientos para los epítopes Th promiscuos que proporcionan amplias responsividad (Bianchi et al., EP 0427347; Sinigaglia et al., chapter 6 in Inmunological Recognition of Peptides in Medicine and Biology, ed., Zegers et al., CRC Press, 1995, pp 79-87).

Es claro que para la inducción de anticuerpos, el inmunógeno debe comprender el determinante de las células B y el determinante o los determinantes de células mixtas Th. Comúnmente, para incrementar la inmunogenicidad de un objetivo, la respuesta Th se proporciona por el acoplamiento del objetivo a una proteína portadora. Las desventajas de esta técnica son muchas. Es difícil fabricar conjugados de proteína portadores de péptidos bien definidos, seguros, y efectivos por las siguientes razones:

1. El acoplamiento químico son reacciones al azar que introducen heterogeneidad de tamaño y composición, por ejemplo, conjugación con glutaraldehído (Borras-Cuesta et al., Eur J Immunol, 1987; 17: 1213-1215);

2. la proteína portadora introduce un potencial para respuestas inmunes indeseables tales como reacciones alérgicas y autoinmunes (Bixler et al., WO 89/06974);

3. la gran proteína portadora de péptido produce respuestas inmunes irrelevante predominantemente mal dirigidas hacia la proteína portadora más que al sitio objetivo (Cease et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1987; 84: 4249-4253); y

4. la proteína portadora también introduce un potencial para la supresión epitópica en un huésped el cual se ha inmunizado previamente con un inmunógeno que comprende la misma proteína portadora. Cuando un huésped se inmuniza subsecuentemente con otro inmunógeno en donde la misma proteína portadora se acopla a un diferente hapteno, la respuesta inmune resultante se mejora para la proteína portadora pero se inhibe para el hapteno (Schutze et al., J Immunol, 1985;...

1. Un epítope de célula asistente T seleccionado del grupo caracterizado porque consiste de SEC. DE IDENT. NO: 6 o 15.

2. Un inmunógeno peptídico representado por las fórmulas

en donde:

A es un aminoácido o una secuencia inmunoestimuladora general, en donde n es más de uno, las A' s individuales pueden ser las mismas o diferentes;

B se selecciona del grupo que consiste de aminoácidos, -HCH(X)CH2SCH2CO-, -NHCH(X)CH2SCH2CO(varepsilon-N)Lys-, -NHCH(X)CH2S-succinimidil(varepsilon-N)Lys-, y -NHCH(X)CH2S-(succinimidil)-;

Th es un epítope de célula T asistente artificial seleccionado del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NO: 6 o 15;

"Sitio antigénico objetivo" es un epítope de célula B, un hapteno peptídico, o un análogo inmunológicamente reactivo de los mismos;

X es un aminoácido a-COOH o -CONH2;

n es de 1 hasta aproximadamente 10;

m es de 1 hasta aproximadamente 4; y

o es de 0 hasta aproximadamente 10.

3. El inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la secuencia inmunoestimuladora es SEC. DE IDENT. NO: 78.

4. El inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque B se selecciona del grupo que consiste de Gly-Gly, (varepsilon-N)Lys-, Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro, -NHCH(X)CH2SCH2CO-, -NHCH(X)CH2SCH2- CO(varepsilon-N)Lys-, -NHCH(X)CH2S-succinimidil(varepsilon-N)Lys-, y -NHCH(X)CH2S-(succinimidil)-.

5. El inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque B es Gly-Gly.

6. El inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque B es (varepsilon-N)Lys.

7. El inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 2, 3, 4, 5 ó 6, caracterizado porque el sitio antígeno objetivo es el antígeno de repetición de

en donde p=4.

8. El inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque se seleccionado del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 104 y 152.

9. El inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 2, 3, 4, 5, ó 6, caracterizado porque el sitio Antígeno Objetivo se selecciona del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 106, 107, 108 y 109, un epítope de CETP.

10. El inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 10, seleccionado del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 110, 112, 116 y 118.

11. El inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 2, 3, 4, 5, ó 6, caracterizado porque el sitio Antígeno Objetivo se selecciona del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 125, 131, 132, 133, 134 y 135 un epítope de VIH.

12. El inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 126, 136, 138, 140, 142, 144, 146 y 148.

13. El inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 12, comprendiendo SEC. DE IDENT. NO: 148.

14. Un método para producir un inmunógeno peptídico al enlazar covalentemente un epítope de célula asistente T de la reivindicación 1 a un sitio antigénico objetivo seleccionado del grupo que consiste de epítopes de células B de un antígeno y un hapteno peptídico.

15. El método para producir un inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque enlaza adicionalmente el epítope de célula asistente T enlazado covalentemente y un sitio antigénico objetivo a una secuencia inmunoestimuladora.

16. El método para producir un inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la secuencia inmuestimuladora es la SEC. DE IDENT. NO: 78.

17. El método para producir un inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque B se selecciona del grupo que consiste de Gly-Gly, (varepsilon-N)Lys, Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro, -NHCH(X)CH2SCH2CO-, -NHCH(X)CH2SCH2CO(varepsilon-N)Lys-, -NHCH(X)CH2S-succinimidil(varepsilon-N)Lys-, and -NHCH(X)CH2S-(succinimidil)-

18. El método para producir un inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque B es Gly-Gly.

19. El método para producir un inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque B es (varepsilon-N)Lys.

20. El método para inducir una respuesta de célula asistente T in vitro al emplear un inmunógeno peptídico de conformidad comprende el célula asistente T con la reivindicación 1.

21. El método para inducir una respuesta de célula asistente T in vitro al emplear un inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 2.

22. El método para inducir una respuesta de célula asistente T in vitro al emplear un inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 3.

23. El método para inducir una respuesta de célula asistente T in vitro al emplear un inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 4.

24. El método para inducir una respuesta de célula asistente T in vitro al emplear un inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 5.

25. El método para inducir una respuesta de célula asistente T in vitro al emplear un inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 6.

26. El método para inducir una respuesta de célula asistente T in vitro al emplear un inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 7.

27. El método para inducir una respuesta de célula asistente T in vitro al emplear un inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 8.

28. El método para inducir una respuesta de célula asistente T in vitro al emplear un inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 9.

29. El método para inducir una respuesta de célula asistente T in vitro al emplear un inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 10.

30. El método para inducir una respuesta de célula asistente T in vitro al emplear un inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 11.

31. El método para inducir una respuesta de célula asistente T in vitro al emplear un inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 12.

32. El método para inducir una respuesta de célula asistente T in vitro al emplear un inmunógeno peptídico de conformidad con la reivindicación 13.