Polipéptido capaz de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA (VIH) que consiste esencialmente en una secuencia con al menos un 70% de homología con la región C3-C5 de la proteína gp120 del virus

Polipéptido de la proteína gp120 capaz de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA.

La presente invención se refiere a un polipéptido correspondiente a la región C3-C5 de la proteína gp120 del virus del SIDA (el VIH) y al polinucleótido codificante por dicho polipéptido, capaz de ofrecer un efecto protector a las células frente a la infección por el VIH.

Estado de la técnica anterior

Las estrategias más comúnmente empleadas para combatir el virus del SIDA (el VIH) fueron desarrolladas a principios de los noventa. En general, estaban relacionadas con la capacidad inhibitoria de al menos tres diferentes moléculas que actuaban sobre una o dos enzimas vitales para el virus: retrotranscriptasas y proteasas. La combinación de fármacos basados en estas moléculas, conocida como terapia anti-retroviral altamente activa (HAART), ha mejorado el pronóstico de pacientes con SIDA. Sin embargo, la HAART no es capaz de erradicar al virus, que se mantiene latente en el interior celular, por lo que los distintos fármacos deben administrarse continuamente. Este hecho, junto con los efectos secundarios de dichos fármacos y la aparición de cepas resistentes del virus hace necesario buscar alternativas a este tratamiento.

A finales de los noventa, se ideó como tratamiento potencial para los pacientes de SIDA la generación de células capaces de expresar genes con actividad antiviral (la denominada inmunización intracelular). Así, se demostró por ejemplo que un mutante dominante del gen gag (que codifica por una proteína precursora de distintas proteínas del VIH) tenía actividad antiviral (Trono, D., et al., Cell, 1989. 59(1): 113-20). Se han descrito otras estrategias basadas en este enfoque, para interferir directamente en la replicación del virus o eliminar las células infectadas. Además, la terapia génica frente a VIH ha entrado en fase clínica empleando, entre otros, el gen rev (la proteína Rev regula la expresión de genes que codifican por proteínas estructurales del virus) o el gen tat (la proteína tat es un trans-activador de la transcripción). Estas y otras terapias génicas han sido revisadas por Fanning, G. et al., J Gene Med, 2003. 5(8): 645-53.

Diversas líneas en la lucha contra el SIDA se han enfocado al bloqueo de las primeras fases del ciclo vital del VIH, que comienza cuando la glicoproteína gp120 de su envuelta reconoce al receptor CD4 de la superficie de membrana de algunos tipos celulares. Para el progreso de la infección por VIH la diana principal son los denominados linfocitos CD4+, aquellos que presentan dicho receptor. En este caso, gp120 reconoce además a los co-receptores CCR5 y CXCR4. La glicoproteína gp120 proviene del procesamiento del precursor g160, que es sintetizado en el retículo endoplasmático de las células infectadas y que, por la acción de proteasas del aparato de Golgi, produce tanto gp120 como gp41. Estas glicoproteínas de la envuelta del VIH se organizan formando trímeros, de forma que cada complejo de la envuelta del virus contiene tres unidades de la gp120 y otras tres de gp41. Una vez que la gp120 interacciona con el receptor CD4, se induce un cambio conformacional en gp41, que inserta una región hidrofóbica en la membrana de la célula y permite fusionar la partícula viral con la membrana celular para que su carga genética pase al interior celular.

Tanto gp160, gp120, como gp41, han sido empleadas para combatir la infección por VIH mediante células transformadas (WO89/05349, WO94/22477) y anticuerpos contra el virus (WO03/106496). En ciertos casos las estrategias se han concentrado en inhibir la entrada del virus impidiendo su fusión con la membrana celular, por ejemplo desarrollando moléculas que interfieren en el cambio conformacional de gp41 (Kilby, J.M., et al., Nat Med, 1998. 4(11): 1302-7). En otros, el enfoque se ha centrado en impedir el procesado del precursor gp160, pues éste es un paso crucial para la formación de las partículas virales en las células infectadas.

Dentro de estas últimas estrategias, los inventores habían diseñado anteriormente un vector retroviral que contenía en su secuencia la quimera denominada CD4varepsilon10. Esta era una construcción génica que reunía la secuencia de CD4 y la correspondiente a 10 aminoácidos de la señal de retención de CD3varepsilon en el retículo endoplasmático, siendo CD3varepsilon una de las cadenas peptídicas que forman parte del complejo receptor de los linfocitos T (Mallabiabarrena, A. et al., Nature, 1992. 357(6379): 593-6). El péptido originado por expresión de la quimera CD4varepsilon10 se retenía en dicho retículo y este efecto provocaba la inhibición de la replicación de VIH-1 al interaccionar con la proteína viral gp160, reteniéndola en el retículo endoplasmático y evitando su exportación al aparato de Golgi y por tanto su procesamiento en gp120 y gp41 (San José, E. et al., Hum. Gene. Ther., 1998. 9(9): 1345-57). De esta manera, la expresión estable del gen CD4varepsilon10 en las células T transducidas las protegió de los efectos patogénicos del virus. Además, la aplicación de esta estrategia a linfoblastos T de pacientes seropositivos utilizando como vector para la transducción partículas derivadas del virus Mo-MLV inhibió la depleción de las poblaciones de linfocitos CD4+. Sin embargo estos estudios no pudieron efectuarse en condiciones óptimas, pues el vector utilizado no permitía un seguimiento del progreso de la transducción y por otra parte el título viral de los sobrenadantes de los cultivos de células transducidas (relacionado por tanto con el número de vectores virales que se replican con éxito y son capaces de extender la transducción) era bajo.

Explicación de la invención

Los autores de la presente invención han descubierto que, sorprendentemente, la transducción genética estable de linfocitos T mediante vectores virales que contienen una secuencia quimera o polinucleótido quimérico de ADN, denominada CD4varepsilon15, que codifica para el receptor de membrana CD4 y para una señal de retención en el retículo endoplasmático de la cadena CD3varepsilon del complejo receptor de membrana de los linfocitos, no sólo protege a estos linfocitos transducidos de los efectos de la infección por VIH, sino que al mismo tiempo actúa produciendo un factor antiviral que protege a otros linfocitos T no transducidos.

Los inventores han utilizado vectores virales bi-cistrónicos, logrando en los linfocitos T transducidos la co-expresión de la quimera CD4varepsilon15 con la de la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), debido a la inclusión en el vector de una secuencia IRES (del inglés "Internal Ribosome Entry Site"), que permite ligar la expresión de la quimera al de la EGFP. La expresión de EGFP en células transducidas permite el seguimiento de su número mediante citometría de flujo y consecuentemente ha facilitado la demostración de que la expresión de la quimera CD4varepsilon15 en un pequeño porcentaje de los linfocitos T de un cultivo celular es suficiente para proteger frente a la infección por VIH tanto a las células transducidas como a las no transducidas.

El efecto protector de las propias células transducidas se logra en parte porque la expresión de CD4varepsilon15 previene la maduración en la célula infectada por VIH de la proteína precursora gp160, necesaria para originar las proteínas gp120 y gp41 de la envuelta del virus; por lo que aunque el gen del VIH que codifica por gp160 se expresa dentro de la célula y se producen partículas del VIH éstas no son infectivas.

Por su parte, el efecto protector sobre las otras células no transducidas se debería a que la expresión en las transducidas de la quimera conduce a la síntesis de un fragmento de gp120, soluble, y que es secretado al medio. Este factor competiría con la gp120 de la envuelta de las partículas de VIH en su unión al receptor CD4, impidiendo la unión del virus a dichos receptores y por tanto el desarrollo de su ciclo vital.

Se ha aceptado generalmente que, para que este tipo de terapia sea eficaz, es necesario que las células a proteger estén transducidas por los vectores que contienen el gen "protector", por lo que es particularmente importante lograr vectores con eficacia transductora cercana al 100%. La presente invención ha mostrado inesperadamente que aunque sólo un porcentaje minoritario (del 10% o menor) de las células de un cultivo estén transducidas con la quimera CD4varepsilon15, es posible lograr una inhibición de la replicación del virus VIH de más de 100.000...

1. Polipéptido capaz de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA (VIH) que comprende una secuencia con al menos un 70% de homología con la región C3-C5 de la proteína gp120 del virus.

2. Polipéptido según la reivindicación anterior que comprende una secuencia con al menos un 90% de homología con la región C3-C5 de la proteína gp120 del virus.

3. Polipéptido capaz de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA (VIH) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la región C3-C5 es la SEQ ID NO: 1.

4. Polinucleótido capaz de codificar por un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

5. Polinucleótido según la reivindicación anterior cuya secuencia es la SEQ ID NO:2.

6. Vector que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5.

7. Vector según la reivindicación 6 que además comprende al menos una secuencia control que permite la expresión de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5

8. Célula transfectada capaz de producir un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizada porque comprende:

a. un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, 6
b. un vector según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7.

9. Célula transfectada según la reivindicación anterior donde dicha célula es una célula madre hematopoyética o progenitora de células linfáticas.

10. Célula transfectada según la reivindicación 8 donde dicha célula es un linfocito T.

11. Célula transfectada según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 donde dichas células son de origen humano.

12. Composición farmacéutica para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención frente al virus del SIDA (VIH) que comprende:

a. un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o
b. un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, o
c. un vector según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, o
d. una célula transfectada según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.

13. Método para la obtención o identificación de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 que comprende:

a. transfectar células hematopoyéticas, linfoblásticas, ó linfocitos T, con un polinucleótido quimérico que comprende la secuencia del receptor CD4 y una segunda secuencia que codifica para una señal de retención a retículo endoplasmático de al menos 12 amino ácidos.
b. infectar las células de la etapa (a) con al menos una cepa del virus del SIDA, y
c. aislar al polipéptido capaz de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA de la fracción soluble de un extracto obtenido a partir de las células infectadas de la etapa (b).

14. Método según la reivindicación anterior donde la señal de retención en el retículo endoplasmático es un fragmento de CD3varepsilon de al menos 12 amino ácidos.

15. Método según la reivindicación 13 donde el fragmento de CD3varepsilon tiene la secuencia seleccionada del grupo:

a. la SEQ ID NO:3 o variantes alélicas de la misma.
b. secuencia con al menos un 75% de homología con SEQ ID NO:3 o variantes alélicas de la misma.

16. Polinucleótido quimérico para llevar a cabo el método según la reivindicación 13 que comprende la secuencia que codifica para el receptor CD4 y una segunda secuencia que codifica para una señal de retención en el retículo endoplasmático de al menos 12 amino ácidos.

17. Polinucleótido quimérico según la reivindicación anterior donde la señal de retención en el retículo endoplasmático es un fragmento de CD3varepsilon.

18. Polinucleótido quimérico según la reivindicación anterior donde el fragmento de CD3varepsilon tiene la secuencia seleccionada del grupo:

a. la SEQ ID NO:3 o variantes alélicas de la misma.
b. secuencia con al menos un 75% de homología con SEQ ID NO:3 o variantes alélicas de la misma.

19. Célula transfectada hematopoyética, linfoblástica ó linfocito T, para llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 13-15 que comprende un polinucleótido quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.

20. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la elaboración de una vacuna.

21. Uso de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones de 4 a 5 para la elaboración de una vacuna.

22. Uso de una célula transfectada según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 para la elaboración de una vacuna.