EPÍTOPOS DE CÉLULAS T AUXILIARES COMO ESTIMULANTES INMUNITARIOS PARA INMUNÓGENOS PEPTÍDICOS SINTÉTICOS.

Epítopos de células T auxiliares como estimulantes inmunitarios para inmunógenos peptídicos sintéticos CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a un inmunógeno peptídico que comprende un nuevo epítopo de células T auxiliares (Th) artificial conectado covalentemente a un sitio antigénico diana deseado que comprende epítopos de células B y opcionalmente una secuencia estimulante inmunitaria general. El epítopo de Th artificial imparte al inmunógeno peptídico la capacidad de inducir fuertes respuestas inmunitarias mediadas por células T auxiliares y la producción de anticuerpos dirigidos contra el sitio antigénico diana. La invención también proporciona la sustitución ventajosa de proteínas portadoras y sitios de células T auxiliares derivados de patógenos en inmunógenos peptídicos establecidos mediante los nuevos epítopos de células T auxiliares artificiales para una inmunogenicidad mejorada. Se han desarrollado muchas reglas para predecir las secuencias de aminoácidos de epítopos de células T. Sin embargo, debido a que no hay una teoría unificadora central sobre cómo o qué hace a una secuencia de aminoácidos particular útil como un epítopo de células T, las reglas son empíricas y no son aplicables universalmente. Estando al tanto de estas reglas, se desarrollaron los nuevos epítopos de células T auxiliares artificiales de la presente invención, no obstante, mediante investigación empírica. Los inmunógenos peptídicos de la presente invención son útiles para ocasionar respuestas por anticuerpos en un huésped inmunizado a un sitio antigénico diana deseado, incluyendo sitios tomados de organismos patógenos y sitios tomados de autoantígenos normalmente inmunosilenciosos y dianas asociadas a tumores. De acuerdo con esto, los péptidos de la invención son útiles en diversas aplicaciones médicas y veterinarias, tales como: vacunas para proporcionar inmunidad de una enfermedad infecciosa; inmunoterapias para tratar trastornos resultantes de procesos fisiológicos normales que funcionan mal; inmunoterapias para tratar el cáncer y como agentes para intervenir en procesos fisiológicos normales para producir resultados deseables. Por ejemplo, los nuevos epítopos de células T auxiliares artificiales de la presente invención proporcionan nuevos inmunógenos peptídicos cortos que producen anticuerpos dirigidos a hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH) y son útiles para la anticoncepción, el control de tumores dependientes de hormonas, la prevención del olor sexual y la inmunocastración. Se ha encontrado que los nuevos epítopos de Th artificiales de la presente invención provocan una respuesta inmunitaria cuando se combinan con epítopos de células B diana de diversos microorganismos/proteínas/péptidos. Además de LHRH, se ha encontrado que los epítopos de Th artificiales de la presente invención son útiles cuando se conectan a otros sitios antigénicos diana incluyendo somatostatina para la promoción del crecimiento en animales de granja; IgE para el tratamiento de la alergia; el receptor CD4 de células T auxiliares para el tratamiento y la prevención de la infección por HIV y trastornos inmunitarios; proteína de la cápsida del virus de la fiebre aftosa para la prevención de la fiebre aftosa; epítopos del virión del HIV para la prevención y el tratamiento de infección por HIV; el antígeno de circumsporozoitos de Plasmodium falciparum para la prevención y el tratamiento de la malaria; y proteína de transporte de ésteres colesterílicos (CETP) para la prevención y el tratamiento de la arteriosclerosis. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se sabe que la mayoría de las respuestas inmunes por anticuerpos están mediadas por células, requiriendo la interacción cooperativa entre células que presentan antígenos, células B (células que producen anticuerpos que también funcionan como células que presentan antígenos) y células T auxiliares (Th). Por consiguiente, la inducción de una respuesta por anticuerpos eficaz requiere que las células B reconozcan el sitio antigénico diana (epítopo de células B) de un inmunógeno del sujeto y las células T auxiliares reconozcan un epítopo de Th. Generalmente, el epítopo de células T auxiliares sobre un inmunógeno del sujeto es diferente de su epítopo o epítopos de células B (Babbitt et ál., Nature, 1985; 317: 359-361). El epítopo de células B es un sitio sobre la diana deseada reconocido por células B que en respuesta producen anticuerpos para el sitio diana deseado. Se entiende que la conformación natural de la diana determina el sitio al que se une directamente el anticuerpo. Sin embargo, el reconocimiento de proteínas por células T auxiliares es mucho más complejo y peor entendido. (Cornette et ál., en Methods in Enzymology, vol 178, Academic Press, 1989, pp 611-634). Bajo las presentes teorías, la provocación de una respuesta de células Th requiere que el receptor de células T auxiliares reconozca no la diana deseada sino un complejo sobre la membrana de la célula que presenta antígeno formado entre un fragmento peptídico procesado de la proteína diana y un complejo de histocompatibilidad principal (MHC) de clase II asociado. Así, se requiere el procesamiento peptídico de la proteína diana y un reconocimiento triple para la respuesta de células T auxiliares. El complejo de tres partes es particularmente difícil de definir ya que los residuos de contacto del MHC clase II críticos están situados variablemente dentro de diferentes péptidos de unión del MHC (epítopos de Th) y estos péptidos son de longitudes variables con diferentes secuencias de aminoácidos (Rudensky et ál., Nature, 1991; 353:622-627). Además, las propias moléculas del MHC clase II son 2   altamente diversas dependiendo de la constitución genética del huésped. De hecho, se ha observado que ciertos péptidos solo se unen a los productos de alelos del MHC clase II particulares. Así, es difícil identificar epítopos del Th promiscuos, es decir, aquellos que son reactivos a través de especies y a través de individuos de una sola especie. Se ha encontrado que la reactividad de los epítopos de Th es diferente incluso entre individuos de una población. Los múltiples y variados factores para cada una de las etapas constituyentes del reconocimiento de células T: el procesamiento peptídico apropiado por la célula que procesa el antígeno, la presentación del péptido por una molécula del MHC clase II genéticamente determinada y el reconocimiento del complejo molécula del MHC/péptido por el receptor sobre células T auxiliares han hecho difícil determinar los requisitos para los epítopos de Th promiscuos que proporcionan amplia capacidad de respuesta (Bianchi et ál., EP 0427347; Sinigaglia et ál., capítulo 6 en Immunological Recognition of Peptides in Medicine and Biology, ed., Zegers et ál., CRC Press, 1995, pp 79-87). Está claro que para la inducción de anticuerpos, el inmunógeno debe comprender tanto el determinante de células B como el determinante o los determinantes de células Th. Comúnmente, para incrementar la inmunogenicidad de una diana, la respuesta de Th se proporciona al acoplar la diana a una proteína portadora. Las desventajas de esta técnica son muchas. Es difícil fabricar conjugados de péptido-proteína portadora bien definidos, seguros y eficaces por las siguientes razones: 1. El acoplamiento químico son reacciones aleatorias que introducen heterogeneidad de tamaño y composición, p. ej. conjugación con glutaraldehído (Borras-Cuesta et ál., Eur J Immunol, 1987; 17: 1213- 1215); 2. la proteína portadora introduce un potencial para respuestas inmunitarias no deseables tales como reacciones alérgicas y autoinmunes (Bixler et ál., WO 89/06974); 3. el péptido-proteína portadora grande ocasiona respuestas inmunes irrelevantes predominantemente mal dirigidas a la proteína portadora en lugar de al sitio diana (Cease et ál., Proc Natl Acad Sci USA, 1987; 84: 4249-4253); y 4. la proteína portadora también introduce un potencial para la supresión epitópica en un huésped que previamente ha sido inmunizado con un inmunógeno que comprende la misma proteína portadora. Cuando un huésped se inmuniza subsiguientemente con otro inmunógeno en el que la misma proteína portadora está acoplada a un hapteno diferente, la respuesta inmunitaria resultante se mejora para la proteína portadora pero se inhibe para el hapteno (Schutze et ál., J Immunol, 1985; 135: 2319-2322). Para evitar estos riesgos, es deseable reemplazar las proteínas portadoras. El auxilio de células T puede suministrarse a un péptido antigénico diana mediante la unión covalente a un determinante de Th promiscuo bien caracterizado. Th promiscuos conocidos se derivan de antígenos de potentes agentes patógenos tales como la proteína F del virus del sarampión (Greenstein et ál.,... [Seguir leyendo]

1. Un epítopo de células T auxiliares seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 31 y 32. 2. Un inmunógeno peptídico representado por la fórmula (A)n-(Sitio antigénico diana)-(B)o-(Th)m-X o (A)n-(Th)m-(B)o-(Sitio antigénico diana)-X o (A)n-(B)o-(Th)m-(B)o-(Sitio antigénico diana)-X o (Sitio antigénico diana)-(B)o-(Th)m-(A)n-X o   (Th)m-(B)o-(Sitio antigénico diana)-(A)n-X en la que: A es un aminoácido o una secuencia inmunoestimulante general, cuando n >1, las A individuales pueden ser iguales o diferentes; B se selecciona del grupo que consiste en aminoácidos, -NHCH(X)CH2SCH2CO-, -NHCH(X)CH2SCH2CO(- N)Lys-, -NHCH(X)CH2S-succinimidil(-N)Lys- y -NHCH(X)CH2S-(succinimidil)-; Th es un epítopo de células T auxiliares artificial (SEQ ID NOS: 31 y 32) ; "Sitio antigénico diana" es un epítopo de células B, un hapteno peptídico, o un análogo inmunológicamente reactivo del mismo; X es un aminoácido -COOH o CONH2; n es de 0 a 10; m es de 1 a 4; y o es de 0 a 10. 3. Un inmunógeno peptídico de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la secuencia inmunoestimulante es SEQ ID No: 78. 4. Un inmunógeno peptídico de acuerdo con la reivindicación 2, en el que B se selecciona del grupo que consiste en Gly-Gly, (-N)Lys, Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro, -NHCH(X)CH2SCH2CO-, -NHCH(X)CH2SCH2CO(-N)Lys-, -NHCH(X)CH2S-succinimidil(-N)Lys- y -NHCH(X)CH2S-(succinimidil)-, en donde Xaa es cualquier aminoácido. 5. Un inmunógeno peptídico de acuerdo con la reivindicación 4, en el que B es Gly-Gly. 6. Un inmunógeno peptídico de acuerdo con la reivindicación 4, en el que B es (-N)Lys. 7. Un inmunógeno peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4, 5 o 6, en el que el sitio antigénico diana es el antígeno repetitivo de Plasmodium falciparum: (Asn-Ala-Asn-Pro)p (SEQ ID NO: 103), 91   en el que p=4. 8. Un inmunógeno peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4, 5 o 6, en el que el sitio antigénico diana se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 106, 107, 108 y 109, un epítopo de CETP. 9. Un inmunógeno peptídico de acuerdo con la reivindicación 8, que consiste en SEQ ID NO: 114. 10. A inmunógeno peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4, 5 o 6, en el que el sitio antigénico diana consiste en SEQ ID NO: 77, un epítopo de LHRH. 11. Un inmunógeno peptídico de acuerdo con la reivindicación 10, seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 71 y 72. 12. Un inmunógeno peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4, 5 o 6, en el que el sitio antigénico diana consiste en SEQ ID NO: 92, un epítopo de IgE-CH3. 13. Un inmunógeno peptídico de acuerdo con la reivindicación 12, seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 98 y 99. 14. Un inmunógeno peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4, 5 o 6, en el que el sitio antigénico diana consiste en SEQ ID NO: 80, un epítopo de somatostatina. 15. Un inmunógeno peptídico de acuerdo con la reivindicación 14, que consiste en SEQ ID NO: 87. 16. Un inmunógeno peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4, 5 o 6, en el que el sitio antigénico diana es un epítopo de FMDV. 17. Un inmunógeno peptídico de acuerdo con la reivindicación 16, seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 101 y 102. 18. Un método para producir un inmunógeno peptídico al conectar covalentemente un epítopo de células T auxiliares de acuerdo con la reivindicación 1 a un sitio antigénico diana seleccionado del grupo que consiste en epítopos de células B de un antígeno y un hapteno peptídico. 19. Un método para producir un inmunógeno peptídico de acuerdo con la reivindicación 18, conectando adicionalmente el epítopo de células T auxiliares y el sitio antigénico diana conectados covalentemente a una secuencia inmunoestimulante. 20. Un método para producir un inmunógeno peptídico de acuerdo con la reivindicación 19, en el que la secuencia inmunoestimulante es SEQ ID NO: 78. 21. Un método para producir un inmunógeno peptídico de acuerdo con la reivindicación 20, en el que B se selecciona del grupo que consiste en Gly-Gly, (-N)Lys, Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro, -NHCH(X)CH2SCH2CO-, -NHCH(X)CH2SCH2CO(-N)Lys-, -NHCH(X)CH2S-succinimidil(-N)Lys- y -NHCH(X)CH2S(succinimidil)-, en donde Xaa es cualquier aminoácido. 22. Un método para producir un inmunógeno peptídico de acuerdo con la reivindicación 21, en el que B es Gly-Gly. 23. Un método para producir un inmunógeno peptídico de acuerdo con la reivindicación 21, en el que B es (-N)Lys. 24. Un método para inducir una respuesta de células T auxiliares in vitro al emplear un inmunógeno peptídico que comprende el epítopo de células T auxiliares de acuerdo con la reivindicación 1. 25. Un método para inducir una respuesta de células T auxiliares in vitro al emplear un inmunógeno peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 17. 92