COMPLEJO SOLUBLE QUE CONTIENE UNA GLICOPROTEÍNA DE SUPERFICIE RETROVIRAL Y FKPA O SLYD.

Método de producción de un complejo soluble que contiene una proteína diana amiloidogénica y una chaperona de la clase peptidil-prolil-isomerasa seleccionada del grupo formado por FkpA y SlyD que comprende mezclar dicha proteína y dicha chaperona en un tampón no fisiológico en el que se solubilizan tanto la proteína como la chaperona y ajustar el tampón a condiciones fisiológicas en las que el complejo proteína-chaperona formado es soluble.

Complejo soluble que contiene una glicoproteína de superficie retroviral y FKPA o SLYD La presente invención se refiere al diagnóstico de la infección por VIH. Específicamente describe la producción de un complejo soluble de glicoproteína de superficie (o glicoproteína transmembrana) retroviral chaperona, en el que la chaperona se selecciona del grupo formado por FkpA y SlyD, y la utilización ventajosa de un complejo chaperona - antígeno, especialmente en la detección de anticuerpos VIH en inmunoensayos. El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es el agente del síndrome de la inmunodeficiencia adquirida, denominado habitualmente por su acrónimo SIDA. Existen dos cepas principales del virus, denominadas VIH-1 y VIH-2. El virus de la IH se halla en la actualidad ampliamente diseminado y constituye una amenaza grave contra la salud y bienestar en todo el mundo, obliga a los sistemas de atención sanitaria públicos a gastar grandes sumas de dinero en el diagnóstico del VIH y el tratamiento del SIDA. Una de las vías de diseminación del virus es la transfusión de sangre o derivados sanguíneos infectados. Prácticamente todos los países industrializados, así como muchos países en vías de desarrollo, requieren actualmente de forma obligatoria el análisis de todas las donaciones de sangre para evitar una mayor diseminación del virus. Es tarea de todos los métodos diagnósticos en este campo diagnosticar la infección por VIH de la sangre de forma lo más fiable y temprana posible después de la infección. Básicamente, se dispone de tres modos de diagnóstico diferentes: (1) diagnóstico de material genómico viral en sangre mediante procedimientos de diagnóstico de ácidos nucleicos sensibles como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (2) detección de antígenos virales en sangre, y (3) detección de anticuerpos contra el VIH en fluidos corporales. Durante el curso de la infección por el VIH, se conocen varias fases diagnósticas distintas y relevantes. En una fase temprana de la infección solamente se hallaran proteínas y péptidos derivados del virus de la IH (fase virémica), no detectándose todavía anticuerpos anti-VIH. En la fase siguiente, que se denomina seroconversión, aparecen anticuerpos contra el VIH, disminuyendo la cantidad de antígenos virales (carga viral). La mayoría de los anticuerpos formados en la fase inicial de la seroconversión pertenecen a la clase M (IgM) de las inmunoglobulinas. Más tarde, la respuesta inmune contra el VIH cambia a las inmunoglobulinas de la clase G (IgG), que constituyen entonces la mayoría de los anticuerpos dirigidos contra el VIH. Durante la evolución ulterior de la infección, el nivel de anticuerpos anti-VIH puede disminuir mientras que la carga viral (la presencia de partículas virales o antígenos virales) en los fluidos corporales puede aumentar de nuevo. El cribado de la presencia de infección por VIH se realiza preferentemente mediante ensayos serológicos que detectan anticuerpos contra antígenos del VIH, en ocasiones combinados con la detección del antígeno VIH. Dado que la respuesta inmune en un paciente concreto cambia durante el curso de la infección y también varía de una paciente a otro, es importante poseer inmunoensayos extremadamente sensibles y fiables que detecten anticuerpos anti-VIH pertenecientes a las subclases IgM e IgG. Se han descrito diversos enfoques diferentes para la detección de la infección por VIH. Es crucial y de mayor importancia la detección precoz, fiable y sensible de anticuerpos contra las proteínas virales. Las proteínas virales, que frecuentemente se denominan antígenos virales, pueden ser detectables solamente en el momento de producirse la infección y en etapas muy tardías de la enfermedad. Por tanto, los ensayos para la detección de antígenos virales, como los ensayos que miden p24 (para el VIH-1) o p26 (para el VIH-2), que son proteínas virales del núcleo, solamente pueden utilizarse en combinación con otros medios diagnósticos para detectar de forma fiable la infección por VIH. Teóricamente se dispone de tres grupos de antígenos virales, que pueden inducir la formación de anticuerpos en el huésped, y que por lo tanto, pueden utilizarse como antígenos en los procedimientos diagnósticos. Estos son las proteínas de la envoltura viral (codificadas por la región génica env), enzimas virales o proteínas reguladoras tales como la transcriptasa inversa o la integrasa (codificadas por la región génica pol) y proteínas estructurales del núcleo (codificadas por la región génica gag). Las proteínas de la envoltura viral son tanto en el VIH-1 como en el VIH-2 glicoproteínas que se sintetizan como polipéptidos precursores de las proteínas (gp 160 para VIH y gp 140 para VIH-2). Estos precursores de alto peso molecular, tras su síntesis, son escindidos respectivamente en gp 120 y gp41 (VIH-1) o gp110 y gp36 (VIH-2). Los polipéptidos más grandes (gp120 o gp110, respectivamente) forman una subunidad de superficie que se asocia a polipéptidos más pequeños que abarcan la membrana (gp41 y gp36, respectivamente) a través de contactos holgados. En muchos huéspedes (pacientes), las proteínas de la envoltura son las dianas preferentes de la respuesta inmune anti-viral. Ratner, L., y otros, Nature 313 (1985) 277-84, han demostrado que especialmente las proteínas que abarcan la membrana de estas proteínas de la envoltura, es decir, pg41 o gp36, respectivamente, poseen el mayor potencial inmunogénico entre estas proteínas virales. Los métodos de inmunoensayo, tales como, por ejemplo, el ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas), que utilizan polipéptidos codificados por el virus de la IH, se han utilizado ampliamente en el diagnóstico y cribado. Los polipéptidos virales se preparan bien directamente, o se derivan a partir de sistemas de expresión in vitro o in 2 E02758265 17-11-2011   vivo utilizando tecnología de ADN recombinante. Ambos modos de producción de antígenos presentan limitaciones importantes. Los polipéptidos derivados a partir de preparaciones virales pueden estar contaminados con virus viables o material genético infeccioso, suponiendo, por tanto, un riesgo para el personal que utiliza el material. El material derivado de forma recombinante puede estar contaminado por proteínas no VIH del huésped, lo que puede dar lugar a una reducción de la especificidad o especificidad de dichos ensayos. En la detección de anticuerpos contra agentes patógenos, tal como los patógenos virales, se utilizan muy frecuentemente y de forma muy ventajosa sistemas de detección de anticuerpos, según el formato del puente del antígeno doble, descrito por ejemplo en US 4.945.042. Los inmunoensayos, según este concepto de puente, requieren la utilización de un antígeno unido directa o indirectamente a una fase sólida y la utilización de este mismo antígeno o de un antígeno con reactividad cruzada fácilmente soluble, detectable directa o indirectamente. Los anticuerpos que se investigan, si están presentes, forman un puente entre el antígeno unido a la fase sólida y el antígeno de detección marcado. Solamente si los dos antígenos quedan unidos mediante anticuerpos específicos se genera una señal positiva. Se han descrito diversos intentos de utilización de gp41 producida de forma recombinante como antígeno para la detección de anticuerpos anti-VIH. La gp41 producida de forma recombinante, con algunas limitaciones, puede utilizarse para detectar anticuerpos anti-VIH. Esta gp41 se utiliza o bien sola o en combinación con otros antígenos VIH para medir los anticuerpos anti-VIH. Actualmente, se conocen ensayos que se dirigen de forma independiente a la detección de antígenos VIH y/o anticuerpos anti-VIH. En WO 93/21346 se describe un ensayo combinado para la detección simultánea del antígeno gp24 y los anticuerpos contra gp41 de VIH-1 y gp36 de VIH-2. En este ensayo, se utiliza una fase sólida la cual se recubre directamente con gp41 producida de forma recombinante. También está bien establecido que la utilización de valores de pH extraordinariamente altos o bajos es un modo de mantener gp41 (o gp36) en solución. Se sabe que la gp41 producida de forma recombinante es soluble a un pH de alrededor o inferior a 3,0 y a un pH superior a 11,0. Desafortunadamente, sin embargo, tanto la gp41 de VIH-1 como la gp36 de VIH-2, son, respectivamente, esencialmente insolubles bajo condiciones de tampón fisiológicas. Los inmunoensayos se llevan a cabo en general a pH fisiológico. Debido a su insolubilidad bajo condiciones de tampón fisiológicas, en varios inmunoensayos los antígenos glicoproteína de la superficie retroviral se utilizan recubiertos directamente sobre un material de fase sólida. Sin embargo, el recubrimiento directo de antígenos sobre materiales de fase sólida es en muchos casos perjudicial y provoca desventajas... [Seguir leyendo]

1. Método de producción de un complejo soluble que contiene una proteína diana amiloidogénica y una chaperona de la clase peptidil-prolil-isomerasa seleccionada del grupo formado por FkpA y SlyD que comprende mezclar dicha proteína y dicha chaperona en un tampón no fisiológico en el que se solubilizan tanto la proteína como la chaperona y ajustar el tampón a condiciones fisiológicas en las que el complejo proteína-chaperona formado es soluble. 2. Método, según la reivindicación 1, en el que el tampón fisiológico comprende un compuesto tampón en una concentración entre 10 y 200 mM y una concentración total de sal entre 20 y 500 mM. 3. Método, según la reivindicación 1, en el que la proteína diana se produce de forma recombinante. 4. Método, según la reivindicación 1, en el que la peptidil-prolil-isomerasa se produce de forma recombinante. 5. Método, según la reivindicación 1, en el que la proteína diana y la peptidil-prolil-isomerasa se producen de forma recombinante. 6. Método, según la reivindicación 1, en el que la proteína diana es una glicoproteína de superficie retroviral. 7. Método, según la reivindicación 1, en el que la proteína diana es gp36 de VIH-2 o gp41 de VIH-1. 8. Método, según la reivindicación 1, en el que la peptidil-prolil-isomerasa es un fragmento con capacidad de unión de la peptidil-prolil-isomerasa. 9. Método de producción de un complejo de glicoproteína de superficie retroviral chaperona que comprende: mezclar una glicoproteína de superficie retroviral y una peptidil-prolil-isomerasa seleccionada del grupo formado por FkpA y SlyD en un tampón no fisiológico en el que se solubilizan tanto la glicoproteína de superficie retroviral como la peptidil-prolil-isomerasa y forman un complejo, y ajustar el tampón a condiciones fisiológicas en las que el complejo es soluble. 10. Método, según la reivindicación 9, en el que la glicoproteína de superficie retroviral se produce de forma recombinante. 11. Método, según la reivindicación 9, en el que la peptidil-prolil-isomerasa se produce de forma recombinante. 12. Método, según la reivindicación 9, en el que la glicoproteína de superficie retroviral y la peptidil-prolilisomerasa se producen de forma recombinante. 13. Método, según la reivindicación 9, en el que la glicoproteína de superficie retroviral es gp36 o gp41 de VIH. 14. Método, según la reivindicación 9, en el que la peptidil-prolil-isomerasa comprende un fragmento con capacidad de unión de la peptidil-prolil-isomerasa. 15. Método de producción de un complejo glicoproteína de superficie retroviral chaperona que comprende: solubilizar una glicoproteína de superficie retroviral unida covalentemente a una peptidil-prolil-isomerasa seleccionada del grupo formado por FkpA y SlyD en un tampón no fisiológico en el que se solubiliza la glicoproteína de superficie retroviral, y ajustar el tampón a condiciones fisiológicas en las que el complejo glicoproteína de superficie retroviral chaperona es soluble. 16. Complejo soluble que comprende: una glicoproteína de superficie retroviral y una peptidil-prolil-isomerasa seleccionada del grupo formado por FkpA y SlyD. 17. Complejo soluble que comprende: una glicoproteína de superficie retroviral y una peptidil-prolil-isomerasa seleccionada del grupo formado por FkpA y SlyD, en el que la glicoproteína de superficie retroviral y la chaperona peptidil-prolil-isomerasa están unidas covalentemente. 18. Complejo según la reivindicación 17, en el que la unión covalente comprende un acoplamiento químico. 19. Complejo, según la reivindicación 18, en el que la unión covalente comprende una unión recombinante. 20. Complejo, según la reivindicación 19, en el que la unión recombinante comprende un enlazador peptídico. 21. Complejo, según la reivindicación 20, en el que el enlazador peptídico comprende al menos 10 aminoácidos. 31 E02758265 17-11-2011   22. Complejo, según la reivindicación 20, en el que el enlazador peptídico comprende al menos 15 aminoácidos. 23. Complejo, según la reivindicación 20, en el que el enlazador peptídico comprende, como máximo, 50 aminoácidos. 24. Complejo, según la reivindicación 20, en el que el enlazador peptídico comprende, como máximo, 40 aminoácidos. 25. Composición que comprende el complejo soluble, según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24. 26. Método de detección de al menos un anticuerpo contra una glicoproteína de superficie retroviral en una muestra que comprende: poner en contacto la muestra con una composición que comprende un complejo que comprende una glicoproteína de superficie y una chaperona peptidil-prolil-isomerasa seleccionada del grupo formado por FkpA y SlyD, y detectar los anticuerpos unidos. 27. Método, según la reivindicación 26, en el que el contacto se realiza bajo condiciones adecuadas para la unión de los anticuerpos a la glicoproteína de superficie. 28. Método, según la reivindicación 27, en el que la detección de los anticuerpos unidos es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-virales en la muestra. 32 E02758265 17-11-2011   33 E02758265 17-11-2011   34 E02758265 17-11-2011   E02758265 17-11-2011   36 E02758265 17-11-2011   37 E02758265 17-11-2011   38 E02758265 17-11-2011   39 E02758265 17-11-2011   E02758265 17-11-2011