Modificación por ingeniería genética basada en secuencia y optimización de anticuerpos de cadena sencilla.

Método para identificar uno o más residuos de aminoácido para sustitución en una posición particular en un agente de unión inmunológica,

comprendiendo el método:

a) proporcionar una primera base de datos de secuencias de aminoácidos de VH y/o VL agrupadas según el subtipo;

b) proporcionar una segunda base de datos de secuencias de aminoácidos de VH y/o VL agrupadas según el subtipo y seleccionadas por tener al menos una propiedad funcional deseable, en el que la propiedad funcional deseable es estabilidad mejorada, solubilidad mejorada, no agregación, una mejora en la expresión y/o una mejora en el rendimiento de replegamiento;

c) determinar la frecuencia de aminoácidos para un residuo de aminoácido en una posición de región de marco de la primera base de datos y en una posición de región de marco correspondiente de la segunda base de datos;

d) determinar el factor de enriquecimiento (RF2:RF1) del aminoácido estableciendo la razón entre la frecuencia relativa de un residuo dentro de la segunda base de datos (RF2) y la frecuencia relativa de un residuo dentro de la primera base de datos (RF1)

e) identificar el residuo de aminoácido

(i) como un residuo de aminoácido preferido para sustitución en la posición de aminoácido correspondiente del agente de unión inmunológica cuando el aminoácido tiene un factor de enriquecimiento de más de 1, o

(ii) como un residuo de aminoácido que va a excluirse en la posición de aminoácido correspondiente del agente de unión inmunológica cuando el residuo de aminoácido tiene un factor de enriquecimiento de menos de 1.

Modificación por ingeniería genética basada en secuencia y optimización de anticuerpos de cadena sencilla. Antecedentes de la invención

Se ha demostrado que los anticuerpos son agentes terapéuticos muy eficaces y satisfactorios en el tratamiento de cáncer, enfermedades autoinmunitarias y otros trastornos. Aunque normalmente se han usado clínicamente anticuerpos de longitud completa, existen varias ventajas que el uso de un fragmento de anticuerpo puede proporcionar, tales como aumento de la penetración tisular, ausencia de función efectora de Fe combinada con la capacidad de añadir otras funciones efectoras y la probabilidad de menos efectos secundarios sistémicos que resultan de una semivida más corta in vivo de manera sistémica. Las propiedades farmacocinéticas de fragmentos de anticuerpo indican que pueden ser particularmente muy adecuados para enfoques terapéuticos locales. Además, los fragmentos de anticuerpo pueden ser más fáciles de producir que los anticuerpos de longitud completa en determinados sistemas de expresión.

Un tipo de fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), que está compuesto por un dominio variable de cadena pesada (Vh) conjugado con un dominio variable de cadena ligera (Vl) por medio de una secuencia de ligador. Por tanto, los scFv carecen de todos los dominios de región constante de anticuerpo y los residuos de aminoácido de la primera superficie de contacto de dominio variable/constante (residuos de superficie de contacto) quedan expuestos al disolvente. Un scFv puede prepararse a partir de un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, molécula de IgG) a través de técnicas de modificación por ingeniería genética recombinantes. Sin embargo, la transformación de un anticuerpo de longitud completa en un scFv da como resultado a menudo escasa estabilidad y solubilidad de la proteína, bajos rendimientos de producción y una alta tendencia a agregarse, lo que eleva el riesgo de inmunogenicidad.

Por consiguiente, se han hecho intentos por mejorar propiedades tales como solubilidad y estabilidad de los scFv. Por ejemplo, Nieba, L. et al. (Prot. Eng. (1997) 1:435-444) seleccionaron tres residuos de aminoácido que se sabe que son residuos de superficie de contacto y los mutaron. Observaron un aumento de la expresión periplasmática del scFv mutado en bacterias, así como una disminución de la tasa de agregación inducida térmicamente, aunque la estabilidad y solubilidad termodinámicas no se alteraron significativamente. También se han notificado otros estudios en los que se llevó a cabo mutagénesis dirigida al sitio en residuos de aminoácido particulares dentro de scFv (véase por ejemplo, Tan, P.H. et al. (1988) Biophys. J. 75:1473-1482; Worn, A. y Plückthun, A. (1998) Biochem. 37:1312-13127; Worn, A. y Plückthun, A. (1999) Biochem. 38:8739-875). En estos diversos estudios, los residuos de aminoácido fueron seleccionados para la mutagénesis basándose en sus posiciones conocidas dentro de la estructura de scFv (por ejemplo, a partir de estudios de modelado molecular).

En otro enfoque, se injertaron las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un scFv escasamente expresado en las regiones de marco de un scFv que se había demostrado que tiene propiedades favorables (Jung, S. y Plückthun, A. (1997) Prot. Eng. 1:959-966). El scFv resultante mostró estabilidad termodinámica y expresión

soluble mejoradas.

El progreso de la modificación por ingeniería genética de scFv para mejorar propiedades funcionales se revisa en, por ejemplo, Worn, A. y Plückthun, A. (21) J. Mol. Biol. 35:989-11. Sin embargo, todavía se necesitan nuevos enfoques que permitan el diseño racional de scFv con propiedades funcionales superiores, en particular enfoques que ayuden al experto en la técnica en la selección de residuos de aminoácido posiblemente problemáticos para la modificación por ingeniería genética.

Monsellier E. et al. (Journal of Molecular Biology, 26, vol. 362, n.° 3, páginas 58-593) dan a conocer un método en el que se comparó una secuencia de interés con la secuencia consenso global para VHA/L y se recuperaron las frecuencias de cada aminoácido en cada posición de un conjunto de bases de datos.

Pommié Christelle et al. (Journal of Molecular Recognition, 1995, vol. 17, n.° 1, páginas 17-232) describen los criterios normalizados de IMGT para el análisis estadístico de propiedades de aminoácidos de inmunoglobulinas.

Déret S. et al. (Computer Applications in the Biosciences: Cabios, 1995, vol. 11, n.° 4, páginas 435-439) describen el programa SUBIM que permite buscar en la base de datos Kabat y determinar el subgrupo de una región variable.

Johnson George etal. (Methods in Molecular Biology, 24, vol. 248, páginas 11-25) es un artículo de revisión sobre la base de datos Kabat que comprende inmunoglobulinas humanas y murinas, entre otras.

Ewert S. et al. (Biochemistry, 23, vol. 42, n.° 6, páginas 1517-1528) dan a conocer la alineación de secuencias de dominios de VH consenso humanos agrupados por dominios de VH con propiedades biofísicas favorables y dominios de VH con propiedades menos favorables.

Knappik A. et al. (Journal of Molecular Biology, 2, vol. 296, n.° 1, páginas 57-86) describen la generación de secuencias HuCAL; se calcularon para cada subgrupo secuencias de ¡nmunoglobulina reordenadas compiladas, alineadas, designadas a su subfamilia y regiones de marco consenso.

Honegger A. et al. (Journal of Molecular Biology. 21, vol. 39, n.° 3, páginas 657-67) describen el esquema de numeración AHo para anticuerpos y proporcionan algunas macros de EXCEL que permiten la renumeración semiautomática de archivos PDB.

Worn et al., (Journal of Molecular Biology, 21, vol. 35, n.° 5, páginas 989-11) es un artículo de revisión sobre la estabilidad de la modificación por ingeniería genética de fragmentos scFv.

El documento WO 1/4817 (ESBATech AG, 21) describes el sistema de control de calidad (QC, Quality Control), es decir, un sistema de selección que permite el aislamiento de intracuerpos que son estables y solubles es un entorno reductor.

El documento WO 3/8451 (Univ. de Zúrich, 23) se refiere a un método para la optimización de constructos de cadena pesada (VH) y ligera (VL) variables de ¡nmunoglobulinas humanas aisladas.

Sumario de la invención

Esta invención proporciona métodos que permiten la identificación de residuos de aminoácido dentro de una secuencia de scFv que son posiblemente problemáticos para la estabilidad y/o solubilidad usando análisis basados en secuencia. Además, pueden seleccionarse residuos de aminoácido identificados según los métodos de la invención para la mutación y pueden prepararse scFv modificados por ingeniería genética que se han mutado y examinarse para detectar propiedades funcionales mejoradas tales como estabilidad y/o solubilidad. En una realización particularmente preferida, la invención proporciona métodos en los que se usa una base de datos de scFv seleccionados funcionalmente para identificar posiciones de residuos de aminoácido que son o bien más o bien menos tolerantes a la variabilidad que las posiciones correspondientes en secuencias de inmunoglobulina de anticuerpos maduros y/o de línea germinal, indicando de ese modo que tales posiciones de residuos identificadas pueden ser adecuadas para la modificación por ingeniería genética para mejorar la funcionalidad de scFv tal como estabilidad y/o solubilidad. Por tanto, la invención proporciona, y demuestra el beneficio de, un enfoque de "consenso funcional" basado en el uso de una base de datos de secuencias de scFv seleccionadas funcionalmente.

En aún otras realizaciones preferidas, la invención proporciona métodos para identificar residuos de aminoácido preferidos que van a sustituirse (o alternativamente, residuos de aminoácido que van a excluirse) posiciones de aminoácido de interés (por ejemplo, posiciones de aminoácido identificadas comparando una base de datos de secuencias de scFv que tienen al menos una propiedad deseable, por ejemplo, tal como se seleccionan con un ensayo de QC, frente a una base de datos de secuencias de anticuerpos maduros, por ejemplo, la base de datos Kabat) en un agente de unión inmunológica. Por tanto, la invención proporciona además métodos de "enriquecimiento/exclusión" para seleccionar un residuo de aminoácido particular. Todavía adicionalmente, la invención proporciona métodos de modificación por ingeniería genética de agentes de unión inmunológica (por ejemplo, scFv, ¡nmunoglobulinas de longitud completa, fragmentos Fab, anticuerpos con un solo dominio (por ejemplo, Dab) y Nanobodies) mutando posiciones de aminoácido de región de marco particulares identificadas usando... [Seguir leyendo]

Método para identificar uno o más residuos de aminoácido para sustitución en una posición particular en un agente de unión inmunológica, comprendiendo el método:

a) proporcionar una primera base de datos de secuencias de aminoácidos de VH y/o VL agrupadas según el subtipo;

b) proporcionar una segunda base de datos de secuencias de aminoácidos de VH y/o VL agrupadas según el subtipo y seleccionadas por tener al menos una propiedad funcional deseable, en el que la propiedad funcional deseable es estabilidad mejorada, solubilidad mejorada, no agregación, una mejora en la expresión y/o una mejora en el rendimiento de replegamiento;

c) determinar la frecuencia de aminoácidos para un residuo de aminoácido en una posición de región de marco de la primera base de datos y en una posición de región de marco correspondiente de la segunda base de datos;

d) determinar el factor de enriquecimiento (RF2:RF1) del aminoácido estableciendo la razón entre la frecuencia relativa de un residuo dentro de la segunda base de datos (RF2) y la frecuencia relativa de un residuo dentro de la primera base de datos (RF1)

e) identificar el residuo de aminoácido

(i) como un residuo de aminoácido preferido para sustitución en la posición de aminoácido correspondiente del agente de unión inmunológica cuando el aminoácido tiene un factor de enriquecimiento de más de 1, o

(¡i) como un residuo de aminoácido que va a excluirse en la posición de aminoácido correspondiente del agente de unión inmunológica cuando el residuo de aminoácido tiene un factor de enriquecimiento de menos de 1.

Método según la reivindicación 1, en el que el residuo de aminoácido de la etapa d) tiene un factor de enriquecimiento de 4 a 6.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera base de datos comprende secuencias de aminoácidos de Vh, Vl o Vh y Vl de línea germinal.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la primera base de datos consiste en las secuencias de aminoácidos de Vh, VL o Vh y Vl de línea germinal.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera base de datos comprende secuencias de aminoácidos de Vh, Vl o Vh y Vl maduras.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la primera base de datos consiste en secuencias de aminoácidos de Vh, VL o Vh y Vl maduras.

Método según la reivindicación 5 ó 6, en el que las secuencias de aminoácidos de Vh, Vl o Vh y VL maduras son de la base de datos Kabat (KDB).

Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la segunda base de datos comprende secuencias de aminoácidos de Vh, Vl o Vh y Vl de anticuerpos scFv seleccionadas a partir de un ensayo de QC.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la segunda base de datos consiste en secuencias de aminoácidos de Vh, Vl o Vh y Vl de anticuerpo scFv seleccionadas a partir de un ensayo de QC.

Método de mejora de un agente de unión Inmunológica, teniendo el agente de unión Inmunológica secuencias de aminoácidos de Vh y/o Vl, comprendiendo el método:

a) identificar una o más posiciones de aminoácido de región de marco para mutación;

b) identificar para cada posición de reglón de marco particular, tal como se Identifica en la etapa a), un residuo de aminoácido preferido para sustitución según el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; y

c) mutar el residuo de aminoácido en cada posición de región de marco particular hacia el residuo de aminoácido preferido identificado en la etapa b)

en el que la etapa a) se realiza asignando un grado de conservación a cada posición de región de marco

12.

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19.

21.

22.

usando el índice de Simpson, y el índice de Simpson para la posición de aminoácido en la segunda base de datos es al menos ,1 menor que el valor índice de Simpson de la posición de aminoácido correspondiente en la primera base de datos.

Método según la reivindicación 1, en el que si el residuo de aminoácido seleccionado para mutación es un residuo de aminoácido de cadena pesada, está en una posición seleccionada del grupo que consiste en 1, 6, 7, 1, 12, 13, 14, 19, 2, 21, 45, 47, 5, 55, 77, 78, 82, 86, 87, 89, 9, 92, 95, 98, 13 y 17 usando la numeración AHo (posiciones de aminoácido 1, 6, 7, 9, 11, 12, 13, 18, 19, 2, 38, 4, 43, 48, 66, 67, 71, 75, 76, 78, 79, 81, 82b, 84, 89 y 93 usando la numeración Kabat), y

en el que si el residuo de aminoácido seleccionado para mutación es un residuo de aminoácido de cadena ligera, está en una posición seleccionada del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 7, 1, 11, 12, 14, 18, 2, 24, 46, 47, 5, 53, 56, 57, 74, 82, 91, 92, 94, 11 y 13 usando la numeración AHo (posiciones de aminoácido 1, 2, 3, 4, 7, 1, 11, 12, 14, 18, 2, 24, 38, 39, 42, 45, 48, 49, 58, 66, 73, 74, 76, 83 y 85 usando la numeración Kabat).

Método según la reivindicación 11, en el que el agente de unión inmunológica comprende una reglón variable de cadena pesada VH3 y la una o más posiciones de aminoácido seleccionadas para mutación se seleccionan del grupo que consiste en las posiciones de aminoácido 1, 6, 7, 89 y 13 de VH3 usando la numeración AHo (posiciones de aminoácido 1, 6, 7, 78 y 89 usando la numeración Kabat).

Método según la reivindicación 11, en el que el agente de unión inmunológica comprende una reglón variable de cadena pesada VH1a y la una o más posiciones de aminoácido seleccionadas para mutación se seleccionan del grupo que consiste en las posiciones de aminoácido 1, 6, 12, 13, 14, 19, 21, 9, 92, 95 y 98 de VH1a usando la numeración AHo (posiciones de aminoácido 1, 6, 11, 12, 13, 18, 2, 79, 81, 82b y 84 usando la numeración Kabat).

Método según la reivindicación 11, en el que el agente de unión inmunológica comprende una región variable de cadena pesada VH1b y la una o más posiciones de aminoácido seleccionadas para mutación se seleccionan del grupo que consiste en las posiciones de aminoácido 1, 1, 12, 13, 14, 2, 21, 45, 47, 5, 55, 77, 78, 82, 86, 87 y 17 de VH1b usando la numeración AHo (posiciones de aminoácido 1,9, 11, 12, 13, 19, 2, 38, 4, 43, 48, 66, 67, 71, 75, 76 y 93 usando la numeración Kabat).

Método según la reivindicación 11, en el que el agente de unión Inmunológica comprende una región variable de cadena ligera Vk1 y la una o más posiciones de aminoácido seleccionadas para mutación se seleccionan del grupo que consiste en las posiciones de aminoácido 1, 3, 4, 24, 47, 5, 57, 91 y 13 de Vk1 usando la numeración AHo (posiciones de aminoácido 1, 3, 4, 24, 39, 42, 49, 73 y 85 usando la numeración Kabat).

Método según la reivindicación 11, en el que el agente de unión inmunológica comprende una región variable de cadena ligera Vk3 y la una o más posiciones de aminoácido seleccionadas para mutación se seleccionan del grupo que consiste en las posiciones de aminoácido 2, 3, 1, 12, 18, 2, 56, 74, 94, 11 y 13 de Vk3 usando la numeración AHo (posiciones de aminoácido 2, 3, 1, 12, 18, 2, 48, 58, 76, 83 y 85 usando la numeración Kabat).

Método según la reivindicación 11, en el que la una o más posiciones de aminoácido seleccionadas para mutación se seleccionan del grupo que consiste en las posiciones de aminoácido 1, 2, 4, 7, 11-, 14, 46, 53, 82, 92 y 13 de VX1 usando la numeración AHo (posiciones de aminoácido 1, 2, 4, 7, 11, 14, 38, 45, 66, 74 y 85 usando la numeración Kabat).

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 11-17, en el que la mutación comprende además una o más (preferiblemente todas) las sustituciones de cadena de una posición de aminoácido de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las posiciones de aminoácido 12, 13 y 144 usando la numeración AHo (posiciones de aminoácido 12, 85 y 13 usando la numeración Kabat).

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 11-18, en el que la una o más posiciones de aminoácido seleccionadas para mutación se mutan a un residuo de aminoácido encontrado en una posición de aminoácido correspondiente en una secuencia de anticuerpo seleccionada a partir de un ensayo de QC.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en el que el agente de unión inmunológica es un anticuerpo scFv, una ¡nmunoglobulina de longitud completa, un fragmento Fab, un Dab o un Nanobody.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 u 11-2, en el que la propiedad funcional es estabilidad mejorada, solubilidad mejorada, no agregación, una mejora en la expresión, una mejora en el rendimiento de replegamiento tras un procedimiento de purificación de cuerpos de inclusión o una combinación de dos o más de dichas mejoras.

Método según la reivindicación 21, en el que la mejora en la expresión se observa en una célula procariota.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y 21-22, con la condición de que la propiedad funcional no sea una mejora en la afinidad de unión a antígeno.