Regiones de marco de inmunoglobulina que demuestran estabilidad potenciada en el entorno intracelular y métodos de identificación de las mismas.

Región de marco de fragmento variable de cadena sencilla (fragmento scFv) que tiene la estructura general:



NH2-VL-enlazador-VH-COOH; o

NH2-VH-enlazador-VL-COOH,

caracterizada porque el dominio VL tiene la secuencia de región de marco de Seq. Id. No. 1 y el dominio VH tiene la secuencia de región de marco de Seq. Id. No. 11,

en la que la región de marco de scFv es estable en condiciones reductoras.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10009857.

Solicitante: ESBATech, an Alcon Biomedical Research Unit LLC.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: WAGISTRASSE 21 8952 SCHLIEREN SUIZA.

Inventor/es: AUF DER MAUR, ADRIAN, BARBERIS, ALCIDE, ESCHER, DOMINIK, TISSOT,KATHRIN, EWERT,STEFAN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K48/00 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica.
  • C07K16/00 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales.
  • C07K16/18 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra materiales animales o humanos.
  • C12N15/09 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.

PDF original: ES-2537104_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Regiones de marco de inmunoglobulina que demuestran estabilidad potenciada en el entorno intracelular y métodos de identificación de las mismas

Campo de ¡a invención

La invención se refiere a la química de proteínas, la biología molecular y la inmunología.

Antecedentes de ia técnica reiacionada

Los anticuerpos pueden reconocer y dirigirse a casi cualquier molécula con alta especificidad y afinidad. Se ha aprovechado esta característica para convertir estas proteínas naturales en poderosas herramientas para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas. Los avances en la tecnología de ADN recombinante han facilitado la manipulación, clonación y expresión de genes de anticuerpos en una amplia variedad de células no linfoides (Skerra, 1988; Martineau, 1998; Verma, 1998). Se han construido varios fragmentos de anticuerpo diferentes para adaptarse de la mejor manera a las diversas aplicaciones. La entidad más pequeña que retiene la capacidad de unión al antígeno completo de la inmunoglobulina parental completa es el fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) (Bird, 1988). Este fragmento de anticuerpo comprende las regiones variables de las cadenas pesada y ligera unidas por un enlazador peptídico flexible, lo que permite la expresión de la proteína de un único gen.

Los fragmentos de anticuerpo tienen varias ventajas importantes en comparación con la molécula de inmunoglobulina completa. Debido a su menor tamaño, se facilita la expresión y se potencia la producción en una variedad de células huésped de expresión, tales como células de E co// (Plückthun, 1996). Además, los fragmentos de anticuerpo permiten una penetración mejorada en tumores en aplicaciones /n v/vo (Yokota, 1992) y pueden unirse covalentemente a diversas moléculas efectoras para enfoques terapéuticos.

Los anticuerpos que se producen de manera natural, que se secretan por células plasmáticas, han evolucionado para funcionar en un entorno oxidante, extracelular. Para obtener su estructura plegada, funcional, generalmente requieren la formación de puentes disulfuro dentro de los dominios independientes, que son cruciales para la estabilidad del plegamiento de la inmunoglobulina. A diferencia de los anticuerpos de longitud completa, los fragmentos de anticuerpo scFv o Fab pueden, en principio, expresarse funcionalmente en un entorno reductor en el interior de cualquier célula y dirigirse a cualquier compartimento para dirigirse a proteínas intracelulares y, por tanto, evocar efectos biológicos específicos (Biocca, 1991). En efecto, algunos fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla intracelulares, que se denominan intracuerpos, se han aplicado satisfactoriamente para modular la función de proteínas diana intracelulares en diferentes sistemas biológicos. Por tanto, se ha demostrado resistencia frente a infecciones virales en biotecnología vegetal (Tavladoraki, 1993; Benvenuto, 1995), se ha mostrado la unión de intracuerpos a proteínas del VIH (Rondon, 1997) y se ha descrito la unión a productos oncogénicos (Biocca, 1993; Cochet, 1998; Lener, 2000). Además, los anticuerpos intracelulares prometen ser una herramienta valiosa en la caracterización de la función de un amplio número de genes ahora identificados a través de la secuenciación del genoma humano (Richardson, 1995; Marasco, 1997). Por ejemplo, pueden usarse en un enfoque de genómica funcional para bloquear o modular la actividad de proteínas recién identificadas, contribuyendo de ese modo a la comprensión de sus funciones. Finalmente, los intracuerpos tienen posibles aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas, por ejemplo en prácticas de terapia génica.

A pesar de estas grandes perspectivas, la generación de intracuerpos funcionales está limitada todavía por su inestabilidad e insolubilidad o propensión a agregarse. El entorno reductor del citoplasma impide la formación de los puentes disulfuro intracatenarios conservados, haciendo por tanto que un alto porcentaje de fragmentos de anticuerpo sean inestables y, como consecuencia, no funcionales en el interior de la célula (Biocca, 1995; Proba, 1997). La estabilidad y la solubilidad de fragmentos de anticuerpo representan, por tanto, un obstáculo importante para la aplicación de intracuerpos como posibles moduladores de la función de la proteína /n v/'vo. Hasta la fecha, no pueden realizarse predicciones sobre los requisitos de secuencia que hacen que un fragmento de anticuerpo sea funcional en un entorno intracelular.

Existe, por tanto, una necesidad de fragmentos de anticuerpo que funcionen bien en una amplia gama de diferentes tipos celulares y puedan usarse, por tanto, como regiones de marco para diversas especificidades de unión. Tales regiones de marco pueden usarse para construir bibliotecas para selección intracelular o pueden servir como aceptor para las partes de unión de un anticuerpo existente.

Además de ser adecuados de forma única para aplicaciones intracelulares, tales fragmentos de anticuerpo o anticuerpos completos basados en regiones de marco de dominios variables muy estables también tienen una ventaja distintiva con respecto a los demás anticuerpos en numerosas aplicaciones extracelulares e /n v/fro. Cuando se producen tales regiones de marco en un entorno oxidante, pueden formarse sus puentes disulfuro, potenciando adicionalmente su estabilidad y haciéndolos sumamente resistentes frente a la agregación y la degradación de proteasas. La semivida /n v/vo (y por tanto la resistencia frente a la agregación y la degradación por proteasas séricas) es, además de la afinidad y la especificidad, el factor individual más importante para el éxito de los anticuerpos en aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico (Willuda, 1999). La semivida de fragmentos de anticuerpo puede aumentarse adicionalmente a través de la unión covalente de moléculas de polímero tales como

polietilenglicol (PEG) (Weir, 2002). Las moléculas estables de este tipo representan un avance significativo en el uso de anticuerpos, especialmente, pero no exclusivamente, cuando no se desea la funcionalidad Fe.

La gran importancia práctica de las bibliotecas de fragmentos de anticuerpo ha motivado la investigación en esta área. Winter (documento EP 0368684) ha proporcionado la clonación inicial y la expresión de genes de regiones variables de anticuerpo. Partiendo de estos genes, se crearon grandes bibliotecas de anticuerpos que tienen alta diversidad tanto en las regiones determinantes de complementariedad (CDR) así como en las regiones de marco. Winter no da a conocer, sin embargo, la utilidad de diferentes regiones de marco para la construcción de bibliotecas.

La enseñanza de Plückthun (documento EP 0859841), por otra parte, ha tratado de mejorar el diseño de bibliotecas limitando las regiones de marco a un número definido de secuencias consenso sintéticas. Los esfuerzos en ingeniería de proteínas que implican la introducción de una gran cantidad de mutaciones diseñadas racionalmente han sugerido previamente mutaciones hacia la secuencia consenso respectiva como un medio adecuado para la mejora de la estabilidad de dominios de inmunoglobulina variables aislados (Ohage 1999; Ohage 1999 y el documento US 5.854.027).

Plückthun (documento EP 0859841) da a conocer métodos para la optimización adicional de las afinidades de unión en estas secuencias consenso. La patente de Plückthun también reconoce el continuo aumento en el conocimiento referente a los anticuerpos y por consiguiente tiene como objetivo incluir tales hallazgos futuros en el diseño de bibliotecas. Sin embargo, no se sugieren posibles mejoras adicionales de las regiones de marco consenso sintéticas.

Las enseñanzas de Winter, Plückthun y otros (por ejemplo Soderlind, documento WO 0175091) han intentado, por tanto, crear grandes bibliotecas de anticuerpos centrándose en la alta diversidad en las CDR para la selección y aplicación de los scFv seleccionados en condiciones oxidantes. Todas estas bibliotecas no están optimizadas, sin embargo, para aplicaciones intracelulares y, por tanto, no son útiles para la selección y las aplicaciones en un entorno reductor, u otras condiciones que establecen requisitos especiales sobre la estabilidad y la solubilidad del fragmento de anticuerpo expresado.

Las cualidades requeridas para que los fragmentos de anticuerpo funcionen bien en un entorno reductor, por ejemplo el citoplasma de células procariotas y eucariotas, no están claras. La aplicación de anticuerpos intracelulares o "intracuerpos" está por tanto actualmente limitada por su comportamiento impredecible en condiciones reductoras, lo que puede afectar sus propiedades de estabilidad y solubilidad (Biocca, 1995; Wom, 2000). Las presentes solicitudes de patente (documentos EP1040201, EP1166121... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1.

Región de marco de fragmento variable de cadena sencilla (fragmento scFv) que tiene la estructura general:

NH2-VL-enlazador-VH-COOH; o NH2-VH-enlazador-VL-COOH,

caracterizada porque el dominio VL tiene la secuencia de reglón de marco de Seq. Id. No. 1 y el dominio VH tiene la secuencia de reglón de marco de Seq. Id. No. 11,

en la que la reglón de marco de scFv es estable en condiciones reductoras.

2.

Reglón de marco de scFv según la reivindicación 1, en la que la reglón de marco se fusiona a una segunda proteína.

10 3.

Reglón de marco de scFv según la reivindicación 2, en la que dicha segunda proteína se selecciona del grupo que consiste en GFP, proteína fluorescente azul potenciada, proteína fluorescente amarilla potenciada, proteína fluorescente clan potenciada, un activador transcrlpclonal y un dominio de unión a ADN.

4.

Reglón de marco de scFv según la reivindicación 3, en la que dicho activador transcrlpclonal es un dominio de activación Gal4.

5.

Reglón de marco de scFv según la reivindicación 3, en la que dicho dominio de unión a ADN es un dominio de unión de LexA o Gal4.

6.

Reglón de marco de scFv, que es una variante de la reglón de marco de scFv según la reivindicación 1 que tiene una secuencia de reglón de marco de scFv que presenta una identidad del 90% o superior con la

secuencia de reglón de marco de scFv según la reivindicación 1, a la vez que mantiene una estabilidad potenciada.

7.

Anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de región de marco del dominio VL y

VH según la reivindicación 1.

8.

Uso de la región de marco de scFv según la reivindicación 1, para el injerto de bucles hipervariables de anticuerpos existentes o para la creación de bibliotecas de anticuerpos.

9.

Anticuerpo o fragmento de anticuerpo según la reivindicación 7, para su uso para la aplicación de diagnóstico y terapéutica, validación de dianas y terapia génica.

10.

Ácido nucleico que codifica para la región de marco de scFv según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, o anticuerpo o fragmento de anticuerpo según la reivindicación 7.

30 11.

Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 10.

12.

Célula huésped que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 10.

13.

Ácido nucleico según la reivindicación 10 para su uso en terapia génica.


 

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