Composiciones y métodos para modular la actividad de proteínas reguladoras del complemento sobre células diana.

Un polipéptido modificado que puede trimerizar y reducir la actividad,

cantidad o densidad de una proteína reguladora del complemento (CRP) sobre una superficie de célula diana, en el que el polipéptido tiene al menos el 90 % de identidad de secuencias con la secuencia de botón de fibra de Ad35 de SEC ID Nº: 3 e incluye los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 123-134 de SEC ID Nº: 2, o sustituciones conservativas de los mismos, en el que el polipéptido incluye adicionalmente los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 242, 279, 282 y 302 de SEC ID Nº: 2, y en el que el polipéptido comprende un primer dominio y un segundo dominio con afinidad de unión por CRP, en el que el primer dominio comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26, SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 29, SEC ID Nº: 30 o SEC ID Nº: 31, y en la que X1 no es aspartato, X2 no es treonina o X3 no es isoleucina.

ANTECEDENTES

El sistema del complemento es el principal efector del aspecto humoral del sistema ¡nmunitario. La vía clásica de activación del complemento Implica la unión de componentes solubles, tales como ciertas clases y subclases de anticuerpos, a dianas de antígeno dentro del cuerpo. Los cambios conformaclonales en las regiones Fe de estos anticuerpos unidos exponen sitios de unión para C1, un componente soluble del sistema del complemento en su estado Inactivo. Tras la unión estable, C1 experimenta cambios conformaclonales que producen actividad de proteasa activa en uno de los subcomponentes de C1. La actividad de proteasa ¡niela una cascada de interacciones altamente reguladas entre los componentes del complemento. Un resultado de la cascada es el ensamblaje de un complejo de ataque de la membrana (MAC) sobre células diana.

Una etapa Importante en la cascada de Interacciones de la activación del complemento es la etapa de convertir el componente C3 en C3b activo debido a que hay enorme amplificación de la señal de activación durante esta etapa. Particularmente, una convertasaC3 Individual puede convertir cientos de moléculas de C3 en C3b. Cada componente de C3b, a su vez, forma parte de una convertasa C5, produciendo C5b. Cada molécula de C5b activada ¡niela la formación del MAC. El MAC es una estructura macromolecular que penetra a través de la membrana celular para crear un poro transmembranarlo. El poro rompe la Integridad de la membrana y permite que iones y moléculas pequeñas difundan libremente a su través, conduciendo a la cltóllsls dependiente del complemento (CDC).

Los anticuerpos monoclonales (mAb) han surgido como una clase potenclalmente poderosa de novedosos agentes terapéuticos para varias enfermedades. Por ejemplo, en el campo de la oncología, hay varios mAb terapéuticos comercializados para el tratamiento de cáncer, y hay cientos de mAb actualmente en desarrollo clínico (véase J. Castillo, et al., Experimental Hematology 36:755-768 (2008)). Muchos de estos mAb terapéuticos operan activando la cascada del complemento que conduce al ensamblaje de MAC sobre células tumorales transformadas, causando CDC. Este enfoque terapéutico puede ser ventajoso debido a que los anticuerpos pueden ser específicamente dirigidos hacia antígenos que son específicos para células tumorales transformadas, evitando así muchos efectos secundarlos resultantes de los tratamientos existentes.

Sin embargo, el potencial terapéutico de los mAb terapéuticos puede limitarse debido a la capacidad de células enfermas para bloquear la destrucción por CDC mediante la expresión de proteínas reguladoras del complemento (CRP) de la membrana, tales como CD35, CD46, CD55 y CD59 (D. Gancz y Z. Fishelson, Molecular Immunology 46:2794-2800 (2009); J. Golay, et al., Blood 98:3383-3389 (2001); K.A. Gelderman et al., Laboratory Investigaron: A Journal of Technical Methods and Pathology 82:483-493 (2002); y N. Donin et al., Clinical and Experimental Immunology 131:254-263 (2003)). CD46 y CD55 bloquean la cascada del complemento en la etapa de activación C3 y CD59 previene el ensamblaje del MAC del complemento (Z. Fishelson et al., Molecular Immunology 40:109-123 (2003)).

Por tanto, existe la necesidad de composiciones y métodos para reducir la presencia de CD35, CD46, CD55 y CD59 sobre la superficie de células diana con el fin de reducir la inhibición mediada por CRP del MAC del complemento.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un polipéptido modificado que puede trimerizar y reducir la actividad, cantidad o densidad de una proteína reguladora del complemento (CRP) sobre una superficie de célula diana, en el que el polipéptido tiene al menos el 90 % de identidad de secuencias con la secuencia de botón de fibra de Ad35 de SEC ID N°: 3 e incluye los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 123-134 de SEC ID N°: 2, o sustituciones conservativas de los mismos, en el que el polipéptido incluye adicionalmente los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 242, 279, 282 y 302 de SEC ID N°: 2, y en el que el polipéptido comprende un primer dominio y un segundo dominio con afinidad de unión por CRP, en el que el primer dominio comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N°: 15, SEC ID N°: 16, SEC ID N°: 17, SEC ID N°: 18, SEC ID N°: 19, SEC ID N°: 20, SEC ID N°: 21, SEC ID N°: 22, SEC ID N°: 23, SEC ID N°: 24, SEC ID N°: 25, SEC ID N°: 26, SEC ID N°: 27, SEC ID N°: 28, SEC ID N°: 29, SEC ID N°: 30 o SEC ID N°: 31, y en la que Xi no es aspartato, X2 no es treonina o X3 no es isoleucina.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención también proporciona un vector que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención.

La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la invención, en la que dicho polipéptido comprende un polipéptido del dominio de botón de

fibra modificado que comprende al menos 40 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID N°: 3.

La Invención también proporciona una composición para reducir los niveles en la superficie celular de CD46, que comprende: (a) una cantidad de un agente eficaz para reducir los niveles en la superficie celular de CD46, comprendiendo el agente una pluralidad del polipéptido de la invención, en la que dicho polipéptido comprende a dominio de botón de fibra de adenovirus modificado, en la que el dominio de botón de fibra de adenovirus modificado puede formar homotrímeros que tienen afinidad potenciada por unirse a CD46 en comparación con homotrímeros formados a partir de una pluralidad de polipéptidos que consiste en SEC ID N°: 3, y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención también proporciona un kit que comprende: (a) el polipéptido de la invención; y (b) un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a un antígeno sobre la superficie de una célula de mamífero e induce citólisis dependiente del complemento.

La invención también proporciona un agente que comprende una pluralidad de polipéptidos del dominio de botón de fibra de adenovirus modificados de la invención, para su uso en un método de potenciar el efecto de un agente terapéutico de anticuerpo en el tratamiento de cáncer, comprendiendo el método: (a) administrar al menos una vez al sujeto mamífero una cantidad del agente que comprende una pluralidad de polipéptidos del dominio de botón de fibra de adenovirus modificados de la invención y que comprende fenilalanina (Phe) en la posición 242, arginina (Arg) en la posición 279, serina (Ser) en la posición 282 y ácido glutámico (Glu) en la posición 302, eficaz para reducir la cantidad de CD46 presente sobre la superficie de una célula diana; y (b) administrar al menos una vez una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico de anticuerpo al sujeto, en el que el agente terapéutico de anticuerpo se une a un antígeno de superficie de células no CD46 expresado sobre la célula diana.

RESUMEN DE LA DESCRIPCIÓN

Este resumen se proporciona para introducir una selección de conceptos de una forma simplificada que se describen adicionalmente a continuación en la Descripción detallada. Este resumen no pretende identificar características clave de la materia reivindicada, ni pretende usarse como una ayuda en determinar el alcance de la materia reivindicada.

En el presente documento se describen composiciones y agentes que pueden reducir la actividad, cantidad o densidad de proteínas reguladoras del complemento (CRP) sobre células diana. Adicionalmente se describen métodos de identificación de tales composiciones y agentes, métodos de preparación y usos de los mismos. Adicionalmente se describen métodos de aumentar la susceptibilidad de una célula diana o tejido a una citólisis dependiente del complemento (CDC) mediada por agente terapéutico y el ensamblaje mediado por el agente terapéutico de un complejo de ataque de la membrana (MAC) sobre la célula diana o tejido.

En un aspecto, se describe una composición que comprende un polipéptido modificado que puede reducir la actividad, cantidad o densidad de una proteína reguladora del complemento (CRP) sobre una superficie de célula diana, en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que no se produce naturalmente. En una realización, el polipéptido produce la ¡nternalización o secuestro de la CRP. En otra realización, el polipéptido se une a la CRP. En ciertas realizaciones, el polipéptido... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido modificado que puede trimerizar y reducir la actividad, cantidad o densidad de una proteina reguladora del complemento (CRP) sobre una superficie de célula diana, en el que el polipéptido tiene al menos el 90 % de identidad de secuencias con la secuencia de botón de fibra de Ad35 de SEC ID N°: 3 e incluye los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 123-134 de SEC ID N°: 2, o sustituciones conservativas de los mismos, en el que el polipéptido Incluye adlclonalmente los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 242, 279, 282 y 302 de SEC ID N°: 2, y en el que el polipéptido comprende un primer dominio y un segundo dominio con afinidad de unión por CRP, en el que el primer dominio comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N°: 15, SEC ID N°: 16, SEC ID N°: 17, SEC ID N°: 18, SEC ID N°: 19, SEC ID N°: 20, SEC ID N°: 21, SEC ID N°: 22, SEC ID N°: 23, SEC ID N°: 24, SEC ID N°: 25, SEC ID N°: 26, SEC ID N°: 27, SEC ID N°: 28, SEC ID N°: 29, SEC ID N°: 30 o SEC ID N°: 31, y en la que Xi no es aspartato, X2 no es treonlna o X3 no es ¡soleucina.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que la CRP es una proteina transmembranaria, o, en el que la CRP es CD46, CD55, CD59 o CD35.

3. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que la célula diana es una célula tumoral o un linfocito B que expresa CD20.

4. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el primer dominio comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N°: 19, en la que X1 no es aspartato; SEC ID N°: 26, en la que X2 no es treonina; o SEC ID N°: 31, en la que X3 no es ¡soleucina.

5. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el segundo dominio comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N°: 19, en la que X1 no es aspartato; SEC ID N°: 26, en la que X2 no es treonina; o SEC ID N°: 31, en la que X3 no es ¡soleucina.

6. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. La composición farmacéutica de la reivindicación 6 que comprende además un segundo agente terapéutico, en la que el segundo agente terapéutico está opcionalmente seleccionado del grupo que consiste en una proteina, un polipéptido, una molécula pequeña, un fármaco, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo híbrido, un conjugado de anticuerpo-fármaco, un ARNIp, un ARN antlsentìdo, un mIARN, un virus y un aptámero, o, en la que el segundo agente terapéutico está opcionalmente seleccionado del grupo que consiste en un agente cltotóxlco, un agente citostàtico, un agente de quimioterapia, un agente de activación del complemento, un modulador de la expresión de CRP, radiación, un agente Inmunomodulador, un agente pro-apoptóslco, un Inhibidor de la proteina de choque térmico, un Inhibidor de la proteasa, un agente deslalllante, un Inhibidor de MMP y un Inhibidor de PKC.

8. Un vector que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

9. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el polipéptido comprende un polipéptido del dominio de botón de fibra modificado que comprende al menos 12 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID N°: 3, en el que el polipéptido incluye al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en Asp207Gly, Thr245Ala e lle256Leu, o una combinación de las mismas, y en el que el polipéptido puede formar homotrímeros que pueden unirse a CD46.

10. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 ó 9, en la que dicho polipéptido comprende un polipéptido del dominio de botón de fibra modificado que comprende al menos 40 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID N°: 3.

11. Una composición para reducir los niveles en la superficie celular de CD46, que comprende:

(a) una cantidad de un agente eficaz para reducir los niveles en la superficie celular de CD46, comprendiendo el agente una pluralidad del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 ó 9, en el que dicho polipéptido comprende un dominio de botón de fibra de adenovirus modificado, en el que el dominio de botón de fibra de adenovirus modificado puede formar homotrímeros que tienen afinidad potenciada por unirse a CD46 en comparación con homotrímeros formados a partir de una pluralidad de polipéptidos que consiste en SEC ID N°: 3, y

(b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Un kit que comprende:

(a) el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 ó 9; y

(b) un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a un antígeno sobre la superficie de una célula de mamífero e induce la citólisis dependiente del complemento.

13. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 6-7 ó 11 para su uso en un método para tratar un sujeto con cáncer, en la que el polipéptido de la composición comprende fenilalanina (Phe) en la posición 242, arginina (Arg) en la posición 279, serina (Ser) en la posición 282 y ácido glutámico (Glu) en la posición 302, y en la que el método comprende administrar al sujeto la composición.

14. Un agente que comprende una pluralidad de polipéptidos del dominio de botón de fibra de adenovirus modificados como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en un método de potenciar el efecto de un agente terapéutico de anticuerpo en el tratamiento de cáncer, comprendiendo el método:

(a) administrar al menos una vez al sujeto mamífero una cantidad del agente que comprende una pluralidad de polipéptidos del dominio de botón de fibra de adenovirus modificados como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y que comprende fenilalanina (Phe) en la posición 242, arginina (Arg) en la posición 279, serina (Ser) en la posición 282 y ácido glutámico (Glu) en la posición 302, eficaz para reducir la cantidad de CD46 presente sobre la superficie de una célula diana; y

(b) administrar al menos una vez una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico de anticuerpo al sujeto, en el que el agente terapéutico de anticuerpo se une a un antígeno de superficie de células no CD46 expresado sobre la célula diana.