Composición de nanofilamentos para el tratamiento de tumores.

Composición de nanofilamentos para el tratamiento de tumores.

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden nanofilamentos y al menos un excipiente para su empleo en el tratamiento antitumoral,

donde los nanofilamentos, que actúan como agentes neoplásicos, están funcionalizados con suero procedente de sangre humana. Asimismo, se contempla el procedimiento de obtención de dichas composiciones.

Composición de nanofilamentos para el tratamiento de tumores Objeto de la invención

La presente invención tiene su campo de aplicación dentro del sector sanitario, principalmente en el sector de la Oncología. En concreto, se refiere a composiciones para el tratamiento de tumores basadas en el empleo de nanofilamentos como agentes antineoplásicos.

Antecedentes de la invención

El Cáncer es una enfermedad altamente heterogénea donde algunas células que se dividen rápidamente escapan a todos los mecanismos de control genético resultando en innumerables mutaciones aleatorias (Navin et al. Tumor evolution infernad by single cell sequencing. Natura 472, 90-94, 2011). Algunos de estas mutaciones son incompatibles con la supervivencia celular, pero otras proporcionan ventajas genéticas sustanciales que inevitablemente conducen a una resistencia a diferentes fármacos. Como resultado, las terapias dirigidas a genes o proteínas son sólo efectivas de forma transitoria hasta que surgen nuevas adaptaciones o mutaciones celulares que eluden el efecto del fármaco. Por esta razón, la resistencia genética a la quimioterapia es uno de los problemas a los que se enfrenta la farmacología a medio plazo.

Los microtúbulos celulares son dianas de numerosos fármacos anticancerosos (Jordán, M.A. & Wilson, L. Microtubules and actin fílaments: Dynamic targets for cáncer chemotherapy. Curr. Opin. Cell Biol. 1, 123-130. 1998; Jordán M. Mechanism ofAction of Antitumor Drugs that Internet with Microtubules and Tubulln. Curr. Med. Chem. 2, 1-17,2012). Estos microtúbulos intracelulares naturales son polímeros ensamblados a partir de subunidades de tubulina que se nuclean y organizan en el centrosoma. Los microtúbulos son polímeros dinámicos que van alternando continuamente entre fases de ensamblaje y desensamblaje en una escala de segundos in vivo (Mitchison, T. & Kirschner, M. Dynamic instability of microtubules gnowth. Natura. 312, 237-242, 1984) (Matson, D. R. & Stukenberg, P.T. Spindle posions and cell fate: A tale oftwo pathways. Mol Interv. 11, 141-150, 2011). Este comportamiento dinámico es crucial para la reorganización del citoesqueleto de la célula durante la proliferación celular (Mitchison, T et al. 1984). De hecho, los fármacos anticancerosos que interfieren con la dinámica los microtúbulos son activos contra un amplio rango de tipos de cáncer y son algunos de los tratamientos antineoplásicos más usados. Estos fármacos se comportan como venenos o disruptores del huso mitótico, perturbando su ensamblaje, lo que provoca a la parada mitótica y eventualmente desencadena la muerte celular (Jordán, M.A.et al, 1989; Matson, D.R. et al, 2011; Zhou, J, et al. Targeting microtubules for cáncer chemotherapy. Curr. Med. Chem. Anti-Cancer Agents, 5, 65-71, 2011).

Así, los fármacos anticancerosos que Interfieren con la dinámica de los microtúbulos son los fármacos más efectivos y más empleados desde hace 50 años. Estos fármacos impiden selectivamente la proliferación celular descontrolada bloqueando la división celular, interfiriendo con la dinámica de los microtúbulos de las células y actuando como agentes proliferativos. Los fármacos de esta familia son la colchicina, la vinblastina y vincristina y los responsables de promover la unión y estabilizar el microtúbulo, como los taxanos (familia del paclitaxel) o las epitolonas. Estos fármacos interaccionan con la molécula de tubulina, en unas regiones muy específicas de la estructura de la beta-tubulina, que el estado de la técnica ha definido claramente (Figura 1).

En particular, el paclitaxel (taxol®) favorece la estabilización de los microtúbulos y provoca la desorganización del huso mitótico y la consiguiente parada del ciclo celular en la transición metafase/anafase, lo que finalmente mata a las células del cáncer por apoptosis.

A pesar de ser uno de los agentes antitumorales más empleados en las últimas décadas, el paclitaxel tiene bastantes desventajas, como su insolubilidad en solventes salinos. Además las células del cáncer han encontrado numerosas formas de escapar de estos fármacos antimitóticos y evadir la muerte celular, por ejemplo (i) modificando mediante mutaciones puntuales el sitio de unión de estas drogas a la tubulina, (ii) mediante modificaciones postransduccionales de las tubulinas, (iii) alterando la composición de isotipos de tubulina en los microtúbulos, (iv) alterando a las proteínas reguladoras de la tubulina o microtúbulos, y finalmente, (v) modificando el propio ciclo celular, acortando o debilitando el SAC o provocando la salida de mitosis por un proceso que se denomina escape o deslizamiento mitótico (del inglés mitotic slippage).

A nivel sistémico todos estos fármacos tienen además innumerables inconvenientes pues son inhibidores de la proliferación de todas las células del organismo, lo cual tiene importantes efectos secundarios en el paciente

que es tratado.

Por ello, desafortunadamente, el desarrollo de resistencias genéticas a estas drogas y su significativa toxicidad insta a encontrar nuevas alternativas terapéuticas para el tratamiento del cáncer.

En este sentido, la nanotecnología proporciona alternativas completamente diferentes a las terapias antineoplásicas tradicionales, empleando estrategias muy distintas a los fármacos, dado que no precisan de genes o proteínas diana para matar las células del cáncer.

De forma particular, los nanotubos de Carbono (NTCs) representan una clase de materiales altamente versátiles que muestran propiedades mecánicas, térmicas y electrónicas muy interesantes. Los NTCs son capaces de atravesar tejidos y penetrar en el interior de las células por diferentes mecanismos, fundamentalmente por endocitosis, donde pueden interactuar con nanoestructuras subcelulares (Shi, X., et al. Cell entry of one dimensional nanomaterials occurs by tip recognition and rotation. Nat. Nanotechnoi. 6, 714-719 (2011), (Lacerda, L. et al. Translocation mechanisms of chemically functionalised carbón nanotubes across plasma membranes. Biomaterials 33, 3334-3343, 2012). Dependiendo de su longitud y diámetro, los diferentes tipos de NTC se comportan de forma diferente in vivo. Se ha descrito ya la interacción de estas fibras con ADN (Li, X., Peng et al. CNTs selective destabilization of dúplex and triplex DNA, inducing B-A transition in solutlon. Nucleic Acids Res. 34, 3670-3676, 2006), filamentos de actina (Holt, B. et al. Carbón nanotubes reorganize actin structures in cells and ex vivo. ACS Nano 4, 4872-4878, 2010) o microtúbulos. En particular, los nanotubos de carbono multipared (MWCNTs) pueden ensamblar polímeros biosintéticos mixtos con tubulina in vitro (Figura 2) (Pampaloni, F. et al. Micnotubule architecture: Inspiration for novel carbón nanotube-based biomlmetlc materials. Trends Biotechnol. 26, 302-310, 2008) (Dinu et al. Tubulin encapsulation of CNTs into functional hybríd assemblies. Small 5, 310-315, 2009) e in vivo (Rodríguez et al, Multiwalled Carbón Nanotubes Display Micnotubule Biomimetic Properties in Vivo, Enhancing Microtubule Assembly and Stabilization. 2012 ACS Nano, vol.6, n° 8, 6614-6625), siendo esta interacción biomimética favorecida por muchos factores. Ambos, microtúbulos y MWCNTs, son polímeros unidimensionales que comparten propiedades como su ratio longltud/diámetro, flexibilidad, autoensamblaje y su tendencia a formar racimos para aumentar su resistencia.

Una vez en el citosol, los MWCNTs interaccionan con la tubulina ensamblando polímeros biosintéticos que interfieren significativamente con la dinámica microtubular, favoreciendo la nucleación ectópica de microtúbulos y desensamblando el centrosoma. Esto da lugar a la desorganización del huso mitótico (Figura 3), bloqueando a las células en metafase y desencadenando la apoptosis. Así, los MWCNTs se comportan como los tradicionales fármacos disruptores del huso mitótico (Matson D.R. et al. 2011) pero con la gran ventaja de que no requieren sitios específicos (dianas moleculares) de unión molecular en la molécula de la tubulina (Figura 1).

Los nanofilamentos en general, y los NTC en particular, al no ser fármacos tradicionales y ser bastante estables químicamente, proporcionan grandes mejoras en la inhibición de la dinámica microtubular. La unión microtúbulo- nanofilamentos no depende de dianas específicas en proteínas sino que funciona por cuestiones morfológicas siendo de esta manera mucho más difícil que las células desarrollen un sistema de resistencia a estos nano- medicamentos (Figura 1). Existen en el estado de la técnica trabajos que confirman los efectos antiproliferativos y propaptóticos de los NTCs en la línea celular HeLa derivada de un cáncer humano (Rodríguez et al, 2012).

Pero para que este...

1. Composición que comprende nanofilamentos y al menos un excipiente para su empleo en el tratamiento antitumoral, donde los nanofilamentos están funcionalizados con suero procedente de sangre humana.

2. Composición según la reivindicación 1 donde el suero es del propio paciente.

3. Composición, según la reivindicación 1, donde los nanofilamentos presentan un diámetro extemo comprendido entre 5 y 50 nm y una longitud comprendida entre 200 y 20.000 nm.

4. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los nanofilamentos son nanotubos de carbono.

5. Composición según la reivindicación 4 donde los nanotubos de carbono son multipared.

6. Composición, según la reivindicación 5 donde los nanotubos de carbono presentan de 3-12 paredes de grafeno.

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 donde la concentración de nanofilamentos está comprendida entre 0,1-100 pg/ml de excipiente.

8. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su empleo en el tratamiento antitumoral por vía tópica, parenteral o por depósito tras resección quirúrgica.

9. Composición, según la reivindicación 8, para su empleo en el tratamiento de tumores de la piel.

10. Composición, según las reivindicaciones 1-9 para su empleo en el tratamiento de tumores con riesgo de metástasis.

11. Procedimiento para la obtención de la composición de las reivindicaciones 1-10 que comprende los siguientes pasos:

a) Lavado de los nanofilamentos con HCI,

b) Reajuste del pH de los nanofilamentos obtenidos en a) mediante lavado con buffer fosfato por centrifugación hasta alcanzar un pH fisiológico,

c) Resuspensión de los nanofilamentos obtenidos en b) en una mezcla formada por suero y un excipiente mediante agitación por vórtex,

d) Dispersión de los nanofilamentos mediante la aplicación de ciclos de sonicación a la solución obtenida en c) y eliminación de agregados micrométricos mediante la aplicación de centrifugación tras cada ciclo de sonicación a una velocidad comprendida entre 10.000-13.000 r.p.m, y

e) Recogida de los nanofilamentos dispersados en d) libres de agregados micrométricos.

12. Procedimiento según la reivindicación 11 donde la mezcla del paso c) está formada por el suero y solución salina en una relación 1:10-1:20.