Anticuerpos dirigidos a angiopoyetina-1 y angiopoyetina-2 y uso de los mismos.

Anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que tienen secuencias seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 12;

(b) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 12;

(c) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 17;

(d) SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 12;

(e) SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 12;

(f) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 12;

(g) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11;

(h) SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 12;

(i) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 13;

(j) SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 13;

(k) SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 12;

(l) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 10;

(m) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 16;

(n) SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 11;

(o) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 9;

(p) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 11;

(q) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 10;

(r) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 15;

(s) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8;

(t) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 15;

(u) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 16; y

(v) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 14;

en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a al menos uno de los ligandos Ang1 y Ang2 del receptor Tie2.

Anticuerpos dirigidos a angiopoyetina-1 y angiopoyetina-2 y uso de los mismos Campo de la invención La presente invención se refiere a agentes de unión específica que reconocen y se unen a angiopoyetina-1 (Ang-1) y/o angiopoyetina-2 (Ang-2) . Más específicamente, la invención se refiere a la producción, al uso diagnóstico y al uso terapéutico de anticuerpos monoclonales y policlonales, y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a Ang-1 y/o Ang-2. Aspectos de la invención también se refieren a hibridomas u otras líneas celulares que expresan tales anticuerpos. Los anticuerpos descritos son útiles para el diagnóstico y para el tratamiento de enfermedades asociadas con la actividad y sobreproducción de Ang-1 o Ang-2.

Antecedentes de la invención La angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los existentes, es esencial para muchos procesos fisiológicos y patológicos. Normalmente, la angiogénesis está estrechamente regulada por factores pro- y anti-angiogénicos, pero en el caso de enfermedades tales como cáncer, enfermedades neovasculares oculares, artritis y psoriasis, el proceso puede fracasar. Folkman, J., Nat. Med., 1:27-31 (1995) .

Hay varias enfermedades que se sabe que están asociadas con angiogénesis desregulada o no deseada. Tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, neovascularización ocular, tal como retinopatías, incluyendo retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad, psoriasis, hemangioblastoma, hemangioma, arteriosclerosis, enfermedad inflamatoria, tal como una enfermedad inflamatoria reumatoide o reumática, especialmente artritis (incluyendo artritis reumatoide) u otros trastornos inflamatorios crónicos, tales como asma crónica, aterosclerosis arterial o tras trasplante, endometriosis y enfermedades neoplásicas, por ejemplo los denominados tumores sólidos y tumores líquidos (o hematopoyéticos) (tales como leucemias y linfomas) . Otras enfermedades asociadas con angiogénesis no deseada resultarán evidentes para los expertos en la técnica.

Aunque se ha implicado a muchos sistemas de transducción de señales en la regulación de la angiogénesis, uno de los sistemas mejor caracterizados y más selectivos de células endoteliales implica al receptor tirosina cinasa Tie-2 (denominado “Tie-2” o “Tie-2R” (también denominado “ORK”) ; Tie-2 murino también se denomina “tek”) y sus ligandos, las angiopoyetinas (Gale, N. W. y Yancopoulos, G. D., Genes Dev. 13:1055-1066 [1999]) . Hay 4 angiopoyetinas conocidas; de angiopoyetina-1 (“Ang-1”) a angiopoyetina-4 (“Ang-4”) . Estas angiopoyetinas también se denominan “ligandos de Tie-2”. (Davis, S., et al., Cell, 87: 1161-1169 [1996]; Grosios, K., et al, Cytogenet Cell Genet, 84:118-120 [1999]; Holash, J., et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42:1617-1625 [1999]; Koblizek, T. I., et al., Current Biology, 8:529-532 [1998]; Lin, P., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 95:8829-8834 [1998]; Maisonpierre, P. C., et al., Science, 277:55-60 [1997]; Papapetropoulos, A., et al., Lab Invest, 79:213-223 [1999]; Sato, T. N., et al., Nature, 375:70-74 [1998]; Shyu, K. G., et al., Circulation, 98:2081-2087 [1998]; Suri, C., et al., Cell,

87: 1171-1180 [1996]; Suri, C., et al., Science, 282:468-471 [1998]; Valenzuela, D. M., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 96:1904-1909 [1999]; Witzenbichler, B., et al., J Biol Chem, 273:1851418521 [1998]) . Mientras que la unión de Ang-1 a Tie-2 estimula la fosforilación del receptor en células endoteliales cultivadas, se ha observado que Ang-2 tanto agoniza como antagoniza la fosforilación del receptor Tie-2 (Davis, S., et al., [1996], citado anteriormente; Maisonpierre, P.C., et al., [1997], citado anteriormente; Kim, I., J.H. Kim, et al., Oncogene 19 (39) : 4549-4552 (2000) ; Teichert-Kuliszewska, K., P.C. Maisonpierre, et al., Cardiovascular Research 49 (3) : 659-70 (2001) ) .

Los fenotipos de ratones deficientes en Tie-2 y Ang-1 son similares y sugieren que la fosforilación de Tie-2 estimulada por Ang-1 media en la remodelación y estabilización de vasos en desarrollo in utero a través del mantenimiento de la adhesión de células endoteliales-células de soporte (Dumont, D. J., et al., Genes & Development, 8:1897-1909 [1994]; Sato, T. N., et al., Nature, 376:70-14 [1995]; Suri, C., et al., [1996], citado anteriormente) . Se cree que el papel de Ang-1 en la estabilización de los vasos está conservado en el adulto, donde se expresa ampliamente y de manera constitutiva (Hanahan, D., Science, 277:48-50 [1997]; Zagzag, D., et al., Experimental Neurology, 159:391-400 [1999]) . En cambio, la expresión de Ang-2 se limita principalmente a sitios de remodelación vascular, donde se cree que bloquea la función de Ang-1, induciendo de ese modo un estado de plasticidad vascular propicio para la angiogénesis (Hanahan, D., [1997], citado anteriormente; Holash, J., et al., Science, 284:1994-1998 [1999]; Maisonpierre, P. C., et al., [1997], citado anteriormente) .

Numerosos estudios publicados han demostrado supuestamente la expresión de Ang-2 selectiva de vasos en estados patológicos asociados con angiogénesis. Estos estados patológicos incluyen, por ejemplo, psoriasis, degeneración macular y cáncer (Bunone, G., et al., American Journal of Pathology, 155:1967-1976 [1999]; Etoh, T., et al., Cancer Research, 61:2145-2153 [2001]; Hangai, M., et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42:1617-1625 [2001]; Holash, J., et al., [1999] citado anteriormente; Kuroda, K., et al., Journal of Investigative Dermatology, 116:713-720 [2001]; Otani, A., et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 40:1912-1920 [1999]; Stratmann, A., et al., American Journal of Pathology, 153:1459-1466 [1998]; Tanaka, S., et al., J Clin Invest, 103:34-345 [1999]; Yoshida, Y., et al., International Journal of Oncology, 15: 1221-1225 [1999]; Yuan, K., et al., Journal of Periodontal Research, 35:165-171 [2000]; Zagzag, D., et al., [1999] citado anteriormente) . La mayoría de estos estudios se han centrado en el cáncer, en el que muchos tipos de tumores parecen presentar expresión de Ang-2 vascular. En contraposición con su expresión en angiogénesis patológica, la expresión de Ang-2 en tejidos normales es extremadamente limitada (Maisonpierre, P. C., et al., [1997], citado anteriormente; Mezquita, J., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 260:492-498 [1999]) . En el adulto normal, los tres sitios principales de angiogénesis son el ovario, la placenta y el útero; estos son los tejidos primarios en tejidos normales (es decir, no cancerosos) en los que se ha detectado ARNm de Ang-2.

Determinados estudios funcionales sugieren que Ang-2 puede estar implicada en angiogénesis tumoral. Ahmad et al. (Cancer Res., 61:1255-1259 [2001]) describen la sobreexpresión de Ang-2 y muestran que ésta está asociada supuestamente con un aumento en el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de ratón. Véase también Etoh et al., citado anteriormente, y Tanaka et al., citado anteriormente, en las que se presentan datos que asocian supuestamente la sobreexpresión de Ang-2 con hipervascularidad tumoral. Sin embargo, en contraposición, Yu et al. (Am. J. Path., 158:563-570 [2001]) notifican datos para mostrar que la sobreexpresión de Ang-2 en carcinoma de pulmón de Lewis y células de carcinoma mamario TA3 prolongaba supuestamente la supervivencia de ratones a los que se les inyectaron los correspondientes transfectantes.

En los últimos años, diversas publicaciones han sugerido Ang-1, Ang-2 y Tie-2 como una posible diana para terapia anticancerígena. Por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.166.185, 5.650.490 y 5.814.464 dan a conocer cada una el concepto de anticuerpos anti-ligando de Tie-2 y cuerpos de receptor. La publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 2003/0124129A1 describe determinados anticuerpos anti-Ang 2 y su uso en el tratamiento de cáncer. Lin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci USA, 95:8829-8834 [1998]) inyectaron un adenovirus que expresaba Tie2 soluble en ratones; el Tie-2 soluble disminuyó supuestamente el número y tamaño de los tumores desarrollados por los ratones. En un estudio relacionado, Lin et al. (J. Clin. Invest., 100:2072-2078 [1997]) inyectaron una forma soluble de Tie-2 en ratas; este compuesto redujo supuestamente el tamaño tumoral en las ratas. Siemeister et al. (Cancer Res., 59:3185-3189 [1999]) generaron líneas celulares de melanoma humano que expresaban el dominio extracelular Tie-2, inyectaron estas líneas celulares en ratones desnudos y concluyeron que Tie-2 soluble daba como resultado supuestamente una “inhibición significativa”... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que tienen secuencias seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 12;

(b) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 12;

(c) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 17;

(d) SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 12;

(e) SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 12;

(f) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 12;

(g) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11;

(h) SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 12;

(i) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 13;

(j) SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 13;

(k) SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 12;

(l) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 10;

(m) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 16;

(n) SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 11;

(o) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 9;

(p) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 11;

(q) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 10;

(r) SEQ ID NO: 7 ySEQ ID NO: 15;

(s) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8;

(t) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 15;

(u) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 16; y

(v) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 14;

en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a al menos uno de los ligandos Ang1 y Ang2 del receptor Tie2.

2. Molécula de ácido nucleico aislada que codifica para el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1.

3. Vector que contiene una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2.

4. Célula huésped que contiene el vector según la reivindicación 3.

5. Método de preparación del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 que comprende expresar dicho anticuerpo en una célula huésped.

6. Célula huésped según la reivindicación 4 o método según la reivindicación 5, en donde dicha célula huésped es una célula CHO.

7. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable para el mismo.

8. Composición farmacéutica según la reivindicación 7, que comprende además una molécula seleccionada del grupo que consiste en una molécula indicadora, un polímero soluble en agua, una región Fc de anticuerpo y un agente citotóxico.

9. Composición farmacéutica según la reivindicación 8, en la que dicho portador farmacéuticamente aceptable es un agente de formulación farmacéutico.

10. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, que comprende además una región constante de IgG humana.

11. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 10, en el que el isotipo de la región constante de IgG es IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

12. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 11, que comprende además un dominio constante de cadena ligera.

13. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 12, en el que el dominio constante de cadena ligera es un dominio constante kappa.

14. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, que comprende además una región constante de inmunoglobulina humana.

15. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 14, en el que las secuencias de aminoácidos pesadas de región constante se seleccionan de las secuencias de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas, y las secuencias de aminoácidos de cadena ligera de región constante se seleccionan de SEQ ID NO: 44 y 46.

16. Fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 1, en el que el fragmento es un fragmento Fab, F (ab’) 2, Fv, un anticuerpo de cadena sencilla o un fragmento scFv.

17. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 10 a 16, que comprende además un marcador detectable.

18. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 10 a 16 para inhibir la angiogénesis no deseada en un sujeto que lo necesita.

19. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 18, en el que dicha angiogénesis no deseada es cáncer.

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