Preparación farmacéutica liofilizada galénica, estable, de polipéptidos recombinantes que fijan los carbohidratos.

Procedimiento para la fabricación de un medicamento que contiene un polipéptido,

que comprende, como mínimo,un polipéptido recombinante que fija el carbohidrato de una cadena B de una proteína que inactiva los ribosomas oun fragmento funcional de ésta, en el que

a) el polipéptido o un fragmento funcional de este polipéptido es fusionado con un péptido que actúa de formacitotóxica, formando una proteína de fusión;

b) el polipéptido o un fragmento funcional de este polipéptido es unido a otro polipéptido que posee una actividadenzimática rARN-N-glicosidasa;

c) el polipéptido o un fragmento funcional de este polipéptido está unido a otro polipéptido, en el que una actividadenzimática rARN-N-glicosidasa ha sido sustituida por otra actividad citotóxica; o

d) el polipéptido o un fragmento funcional de este polipéptido es unido a una proteína de fusión, comprendiendo unpolipéptido con una actividad enzimática rARN-N-glicosidasa y/u otra actividad citotóxica, en una forma estable enalmacenamiento de larga duración y comprendiendo además un portador farmacéuticamente aceptable;

que comprende una etapa de enfriamiento, congelación, secado por pulverización o secado por liofilización,manteniendo las características farmacológicas del polipéptido en la solución, en el que la solución se caracterizaporque el valor del pH de la solución es superior a pH 6,0 y un sistema de tampón que contiene un disolvente quegarantiza el mantenimiento de este valor de pH, en el que, mediante un secado por liofilización, se añade, comomínimo, un lioprotector a la solución, en un rango de concentración final de 4% a 10%, en el que el lioproptectorconsiste en dextrano/dextranos.

Preparación farmacéutica liofilizada galénica, estable, de polipéptidos recombinantes que fijan los carbohidratos La invención se refiere a un procedimiento para la fabricación de un medicamento que contiene un polipéptido que comprende, como mínimo, un polipéptido recombinante que fija carbohidratos o un fragmento funcional o un derivado de dicho polipéptido que fija carbohidratos en forma estable de almacenamiento. El mencionado polipéptido comprende polipéptidos o derivados funcionales de los mismos, los cuales están fusionados por péptidos con función citotóxica formando proteínas de fusión, o que están unidos con otro polipéptido, el cual presenta actividad citotóxica. Además, la invención se refiere a la formulación del medicamento que se da a conocer, para diferentes formas de administración del medicamento.

La investigación médica ha puesto de manifiesto en los últimos años un amplio espectro de enfermedades que pueden ser tratadas con proteínas recombinantes. Son ejemplos de proteínas de origen humano la insulina, EPO y

G-CSF cuyas formas de administración y tipos de aplicación han sido descritas en diferentes patentes europeas. El documento EP 0 430 200 B1 describe la utilización de proteínas humanas para utilización subcutánea e intramuscular. Se conocen medicamentos con proteínas humanas estabilizadas que contienen, entre otros, urea o distintos aminoácidos, por el documento EP 0 306 824 B1. En dicha patente, se explican como ejemplos EPO y G-CSF. El documento EP 0 607 156 B1 describe la fabricación de medicamentos conservados con proteínas humanas con objetivos de infusión o de inyección.

De modo general, el concepto “recombinante” se refiere a proteínas que son fabricadas con ayuda de tecnología de ADN recombinante. Estos procedimientos comprenden el clonado de genes que codifica para la proteína correspondiente, la inserción del correspondiente cADN o ADN genómico en un sistema detector apropiado y la transformación/transfección de estos vectores en organismos huésped apropiados (bacterias o células eucariotas) . Si el gen clonado se expresa en el organismo huésped, la correspondiente proteína puede ser conseguida a partir de un cultivo (cuando la proteína secretada) se obtiene o de un homogeneizado del organismo huésped (cuando la correspondiente proteína es expresada de forma intracelular) . Se han descrito procedimientos para la fabricación de proteínas recombinantes, tanto para animales como para plantas. Un ejemplo del procedimiento preciso para la fabricación de una proteína de un dímero de plantas se describe en el documento EP 0 751 221 B1. Esta patente describe entre otros, el primer clonado satisfactorio del gen que codifica las subunidades ML. Además, se describen en esta patente, igualmente, la utilización de estas proteínas dímeras de plantas, fabricadas de forma recombinante, para la fabricación de medicamentos.

La utilización de extractos de , muérdago (extractos de Viscum album) como medio curativo, se conocen desde hace siglos. Como componente efectivo de estos extractos, se identificaron sustancias contenidas designadas como lectina. En estas lectinas son sustancias de albúmina que reconocen estructuras de carbohidratos muy específicas, incluso en formas unidas a lípidos o a proteínas y que se unen a éstas. La lectina de muérdago que fue identificada como proteína inactivadora de ribosomas de clase II, actúa farmacológicamente solo a través de la colaboración de sus dos subunidades. La cadena B de la lectina de muérdago, que presenta motivos de secuencia con propiedades específicas de unión a carbohidratos, es responsable en este caso del transporte de la proteína a la célula diana. En las células diana se bloquea entonces la subunidad A mediante su actividad enzimática rARN-N-glicosidasa, el intercambio de sustancias ribosomales de las células y provocan de esta manera, una muerte celular programada (apoptosis) de éstas.

Los preparados farmacéuticos conocidos hasta el momento en el estado de la técnica, contienen de modo general proteínas humanas, proteínas humanizadas, proteínas de plantas que contienen extractos o proteínas aisladas de plantas. Es decisivo para la efectividad de los preparados que contienen proteínas, el mantenimiento de la actividad biológica de estas proteínas. Para rViscumin es, por ejemplo, la estructura dímera y el mantenimiento de las actividades asociadas a las cadenas individuales y la forma de la efectividad farmacológica de estas moléculas. El mantenimiento de estas actividades biológicas es fuertemente dependiente de valor del pH de la solución que contiene la proteína (ver figura 1) . Además, las condiciones de almacenamiento de las correspondientes preparaciones influyen en la estabilidad de un principio medicamentoso/medicamento.

En la patente europea EP 0 602 686 B1 se describió la forma de actuación de la planta de muérdago y los extractos conseguidos a base de la misma para el tratamiento de enfermedades. Los extractos de muérdago se han utilizado terapéuticamente durante siglos, tal como se indica en dicha descripción. Desde el principio de este siglo, se han utilizado preparados de muérdago para terapia de cáncer con diferentes resultados (Bocci, 1993; Gabius y otros, 1994; Gabius & Gabius, 1994; Ganguly & Das, 1994) . Hajto y otros (1989, 1990) pudieron demostrar que los efectos terapéuticos podían ser proporcionados, en especial, mediante la llamada lectina de muérdago (Viscumina, Aglutinina de Viscum album, VAA) . Se discute en la actualidad, aparte de un efecto citotóxico, en especial, una inmunoestimulación (no específica) , cuyos efectos positivos han sido utilizados para terapia acompañante y para cuidados posteriores de pacientes afectados de tumores. El aumento de la calidad de vida en dichos pacientes se habrá conseguido posiblemente por la generación de endorfinas del propio cuerpo (Heiny y Beuth, 1994) .

Numerosas investigaciones in vitro (Hajto y otros, 1990; Männel y otros, 1991; Beuth y otros, 1993a) e in vivo (Hajto, 1986; Hajto y otros, 1989, Beuth y otros, 1991; Beuth y otros, 1992) , así como estudios clínicos (Beuth y otros, 1992) justifican la liberación más elevada provocada por lectina de muérdago de citoquinas inflamatorias (TNF-a, IL-1, IL-6) así como una activación de componentes celulares del sistema inmune (células TH, células NK) .

Como principio activo del extracto de muérdago, se considera en la actualidad una proteína de lectina de muérdago de 60kDa que puede ser conseguida por vía bioquímica a base de extractos (Franz y otros, 1977; Gabius y otros, 1992) . La proteína ML se compone de dos subunidades covalentes unidas en puente S-S, cuyas cadenas A son responsables de la inactivación enzimática de ribosomas (Endo y otros, 1998) y sus cadenas B para la unión de carbohidratos. La actividad biológica se correlaciona con el mantenimiento de la actividad de la lectina de la cadena B (Hajto y otros, 1990) .

La utilización de una forma medicamentosa o bien de un preparado de medicamento con rViscumin como componente activo, presenta una interesante y ventajosa alternativa a la preparación de plantas, puesto que se tiene ahora la posibilidad de utilizar una sustancia clasificada químicamente como medicamento. Precisamente, teniendo 15 en cuenta la elevada toxicidad de la lectina de muérdago, resulta posible una buena tolerancia mediante una dosificación precisa mediante la utilización de proteínas fabricadas de forma recombinante. En este caso, es especialmente ventajosa una forma medicamentosa o una preparación de medicamento que es estable en almacenamiento a lo largo de un prolongado periodo de tiempo, es decir, varios meses, y preferentemente, como mínimo, un año. El almacenamiento de la forma medicamentosa, o bien del preparado de medicamento en esta forma estable al almacenamiento, debe ser posible además de manera simple y sin gran complicación técnica. Además, la forma medicamentosa o bien preparación de medicamento, cuando su forma estable en almacenamiento no corresponde a la forma de administración, puede ser formulable adicionalmente de manera sencilla a una forma de administración correspondiente. Con fórmulas acuosas, según el estado de la técnica, se pueden conseguir tiempos de almacenamiento de menos de 10 semanas (2, 5 meses) en condiciones de almacenamiento de 2-8ºC

(nevera) .

El problema que subyace técnicamente en la presente invención era, por lo tanto, la preparación de un procedimiento para la fabricación de un medio medicamentoso o una preparación de medicamento en una forma estable de almacenamiento durante largo tiempo que posibilite una manipulación simple, tanto en el almacenamiento como también en la administración... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la fabricación de un medicamento que contiene un polipéptido, que comprende, como mínimo, un polipéptido recombinante que fija el carbohidrato de una cadena B de una proteína que inactiva los ribosomas o un fragmento funcional de ésta, en el que a) el polipéptido o un fragmento funcional de este polipéptido es fusionado con un péptido que actúa de forma citotóxica, formando una proteína de fusión;

b) el polipéptido o un fragmento funcional de este polipéptido es unido a otro polipéptido que posee una actividad enzimática rARN-N-glicosidasa;

c) el polipéptido o un fragmento funcional de este polipéptido está unido a otro polipéptido, en el que una actividad enzimática rARN-N-glicosidasa ha sido sustituida por otra actividad citotóxica; o d) el polipéptido o un fragmento funcional de este polipéptido es unido a una proteína de fusión, comprendiendo un polipéptido con una actividad enzimática rARN-N-glicosidasa y/u otra actividad citotóxica, en una forma estable en almacenamiento de larga duración y comprendiendo además un portador farmacéuticamente aceptable;

que comprende una etapa de enfriamiento, congelación, secado por pulverización o secado por liofilización, manteniendo las características farmacológicas del polipéptido en la solución, en el que la solución se caracteriza porque el valor del pH de la solución es superior a pH 6, 0 y un sistema de tampón que contiene un disolvente que garantiza el mantenimiento de este valor de pH, en el que, mediante un secado por liofilización, se añade, como mínimo, un lioprotector a la solución, en un rango de concentración final de 4% a 10%, en el que el lioproptector consiste en dextrano/dextranos.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el otro polipéptido que está unido al polipéptido recombinante que fija el carbohidrato, es la cadena A de una proteína que inactiva los ribosomas.

3. Procedimiento, según la reivindicación 2, en el que la proteína que inactiva los ribosomas es una proteína que inactiva los ribosomas de tipo II.

4. Procedimiento, según la reivindicación 3, en el que la proteína que inactiva los ribosomas es de tipo II rViscumin.

5. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el valor del pH de la solución varía entre 6, 0 y 9, 0.

6. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el valor del pH de la solución varía entre 7, 5 y 8, 5.

7. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la sal o sales del sistema de tampón se

encuentran en un rango de concentración final de 5 mM a 200 mM. 45

8. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la sal o sales del sistema de tampón se encuentran en un rango de concentración final de 100 mM a 200 mM.

9. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la sal o sales de tampón son seleccionadas entre un grupo que comprende: TRIS/HCI, TRICIN/HCI, HEPES/HCI, un tampón de amoniaco carbonato, un ácido TRIS/glutámico y un ácido TRIS/aspártico.

10. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que para estabilizar las características

farmacológicas del polipéptido, la solución contiene una o varias sustancias tensoactivas. 55

11. Procedimiento, según la reivindicación 10, en el que las sustancias tensoactivas son agentes tensoactivos no iónicos, utilizados en un rango de concentración final de 0, 01% a 5, 0%.

12. Procedimiento, según la reivindicación 11, en el que los agentes tensoactivos son seleccionados entre el grupo que comprende: alcoholes grasos, glicéridos parciales, Polysorbats, ésteres de ácidos grasos polioxietilénicos y éteres de ácidos grasos polioxietilénicos, poloxámeros (copolímeros bloque polioxipropileno-polioxietileno) , ésteres de ácido graso de sacáridos, ésteres de ácido graso polioxiglicerólicos y fosfátidos.

13. Procedimiento, según la reivindicación 12, en el que los polisorbatos son seleccionados entre un grupo que 65 comprende Polysorbat 80, Polysorbat 20 y un éter de sorbitol de polioxietileno.

14. Procedimiento, según la reivindicación 12, en el que los éteres de ácido graso polioxietilénicos y los ésteres de ácido graso polioxietilénicos son éteres de macrogol y ésteres de macrogol.

15. Procedimiento, según la reivindicación 12, en el que el poloxámero es plurónico F68, poloxámero 166 o 5 poloxámero 188.

16. Procedimiento, según la reivindicación 12, en el que los fosfátidos son lecitina.

17. Procedimiento, según la reivindicación 10, en el que las sustancias tensoactivas son agentes tensoactivos 10 anfóteros y son utilizados en un rango de concentración final de 0, 01% a 5, 0%.

18. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 17, en el que para un secado por liofilización, se añade dextrano o dextranos a la solución en un rango de concentración final de 4% a 10%, así como crioprotectores, en un rango de concentración final de 0, 01% a 1, 0%.

19. Procedimiento, según la reivindicación 18, en el que el dextrano o dextranos son añadidos en un rango de concentración final de 4, 0 a 10%, así como crioprotectores, en un rango de concentración final de 0, 05 a 0, 1%.

20. Procedimiento, según la reivindicación 18 ó 19, en el que se utilizan sustancias iónicas como crioprotectores. 20

21. Procedimiento, según la reivindicación 20, en el que las sustancias iónicas son seleccionadas entre un grupo que comprende cloruro sódico, sulfato sódico, cloruro potásico y sulfato potásico.

22. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 18 a 21, en el que los lioprotectores y los crioprotectores 25 forman estructuras amorías durante el secado por liofilización.

23. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 22, en el que los estabilizadores son aminoácidos utilizados en un rango de concentración final de 0, 01 a 50 mg/ml.

24. Procedimiento, según la reivindicación 23, en el que los aminoácidos son seleccionados entre el grupo que comprende aminoácidos, tales como ácido glutámico y ácido aspártico, aminoácido básico llamado arginina y aminoácido neutro llamado valina.

Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 24, en el que el polipéptido de una cadena B de una proteína que inactiva los ribosomas, que comprende, como mínimo, un polipéptido recombinante que fija carbohidratos o un fragmento funcional de este polipéptido es utilizado en un rango de concentración final de 10 ng/ml a 10 mg/ml.

26. Procedimiento, según la reivindicación 25, en el que el polipéptido es utilizado en un rango de concentración final 40 de 100 ng/ml a 1 mg/ml.

27. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 26, que comprende además la preparación consecutiva o la reconstitución del medicamento como solución acuosa o no acuosa.

28. Procedimiento, según la reivindicación 27, en el que el medicamento es preparado en forma de solución a inyectar, a instilar o a infundir.

29. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 26, que comprende además la preparación consecutiva o la reconstitución del medicamento para uso gastrointestinal, oral, nasal, pulmonar, dérmico, transdérmico o local. 50

30. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 27, que comprende además la preparación consecutiva del medicamento bajo forma de un jarabe, cápsulas, tabletas, supositorios o gel.

Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 26, que comprende además la preparación consecutiva del 55 medicamento en forma de un material en polvo a inhalar que puede ser administrado en un inhalador.

32. Medicamento fabricado según el procedimiento de las reivindicaciones 1 a 31.