METODO Y KIT DE RECONOCIMIENTO DE CEPAS DE MIROCYSTIS AERUGINOSA (CYANOBACTERIA) PRODUCTORAS Y NO PRODUCTORAS DE MICROCISTINAS.
Método y kit de reconocimiento de cepas de Microcystis aeruginosa (Cyanobacteria) productoras y no productoras de microcistinas.
La presente invención se refiere a un método para detectar cepas productoras de microcistina y cepas no productoras de esta toxina dentro de poblaciones de Microcystis aeruginosa (Cyanobacteria), mediante la utilización de la lectina Aglutinina 1 de Ulex europaeus (UEA-1), de una sonda de marcaje de la lectina y de los medios necesarios para detectar la sonda. Así mismo la invención proporciona un kit para el reconocimiento de cepas productoras y no productoras de microcistina basado en el método descrito
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200901370.
Solicitante: UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID.
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: MADRID.
Inventor/es: MATEOS SANZ,MARIA ARANZAZU, LOPEZ RODAS,VICTORIA, COSTAS COSTAS,EDUARDO, SALGADO VELA,EVA MARIA, CARRERA MARTINEZ,DANIEL.
Fecha de Solicitud: 5 de Junio de 2009.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 29 de Julio de 2011.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/42 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Lectinas, p. ej. concanavalina, fitohemaglutinina.
- C12N1/12 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Algas unicelulares; Sus medios de cultivo (como novedades vegetales A01H 13/00).
- C12R1/89 C12 […] › C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS. › C12R 1/00 Microorganismos. › Algas.
- G01N21/64H
Clasificación PCT:
- C07K14/42 C07K 14/00 […] › Lectinas, p. ej. concanavalina, fitohemaglutinina.
- C12N1/12 C12N 1/00 […] › Algas unicelulares; Sus medios de cultivo (como novedades vegetales A01H 13/00).
- G01N21/64 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 21/00 Investigación o análisis de los materiales por la utilización de medios ópticos, es decir, utilizando rayos infrarrojos, visibles o ultravioletas (G01N 3/00 - G01N 19/00 tienen prioridad). › Fluorescencia; Fosforescencia.
Fragmento de la descripción:
Método y kit de reconocimiento de cepas de Microcystis aeruginosa (Cyanobacteria) productoras y no productoras de microcistinas.
Sector de la invención
La invención se encuadra en el sector de la biotecnología para la sanidad ambiental, y más en concreto, en el relativo a métodos y dispositivos (kits) de reconocimiento de microorganismos productores de toxinas en agua.
Antecedentes de la invención
Las cianobacterias tóxicas engloban un amplio rango de microalgas capaces de proliferar en aguas continentales de todo el mundo, en especial cuando éstas tienen un alto grado de eutrofia, constituyendo una importante preocupación a nivel internacional.
Unas 40 especies de cianobacterias son capaces de producir toxinas (microcistinas). Estas toxinas son capaces de permanecer inalteradas durante largos periodos de tiempo en el medio acuático siendo un peligro potencial para la salud humana así como para la fauna doméstica y silvestre. Varios estudios científicos han demostrado que la microcistina produjo la muerte de 50 personas en Brasil; casos similares han sido descritos en otros países como China, donde los blooms o floraciones de cianobacterias tóxicas son ya un importante problema de salud pública (Zhang et al., 2009. Sci. Total Environ. 407: 2191-9). Recientemente en Europa se ha asociado la presencia de microcistina en el agua de consumo con un incremento en la prevalencia de cáncer de colon e hígado (Martínez et al., 2009. Med. Hypotheses 72: 539-40).
Los blooms de cianobacterias tóxicas también han sido responsables de mortandades masivas de fauna silvestre en reservas naturales protegidas como el caso del Espacio Natural de Doñana descrito por López-Rodas et al. (2008. Vet. Rec. 162: 317-8).
La cianobacteria tóxica que aparece implicada en la mayoría de episodios tóxicos es M. aeruginosa (Kützing), productora de microcistina-LR (hepatotoxina). Sin embargo, no todos los blooms de M. aeruginosa son blooms tóxicos. De hecho, generalmente durante el periodo de máxima proliferación de éstas microalgas y en una misma masa de agua, existen variaciones en la concentración de microcistina. Sivonen y Jones (1999. En Chorus, I. & Bartram, J. [Eds.] Toxic cyanobacteria in water. A guide to their public health consequences, monitoring and management, pp. 41-111. Routledge. London.) indican que uno de los factores fundamentales responsables de la variación de concentración de toxina en el medio, por encima de las condiciones medioambientales, es la presencia de una mezcla de cepas capaces de generar una alta producción de toxina junto con cepas no tóxicas.
En este sentido, diversos estudios han demostrado que existe una gran variabilidad genética respecto a la producción de microcistina en diferentes cepas de M. aeruginosa, concluyendo que existen cepas de M. aeruginosa altamente tóxicas, cepas muy poco tóxicas y cepas no tóxicas (Martín et al., 2004. Limnetica 23 1-2: 153-8).
Ante la toxicidad de M. aeruginosa se han implantado sistemas de control y redes de alerta temprana de la presencia de cepas tóxicas de M. aeruginosa en los embalses destinados a la red abastecimiento urbano así como en aquellas masas de agua de las que se abastecen ganado, y fauna silvestre de interés en conservación (p.e en el Espacio Natural de Doñana).
Para cumplir este objetivo es necesario contar con métodos de detección rápidos que permitan discriminar de manera inequívoca entre cepas tóxicas y no tóxicas de M. aeruginosa. Por el momento no hay un procedimiento eficaz y rápido. Se puede hacer mediante la secuenciación del DNA buscando los genes de la microcistina, pero es un procedimiento complejo y lento. En este sentido el uso de lectinas conjugadas con Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) es una alternativa mucho más sencilla y rápida.
Las lectinas son proteínas o glicoproteínas capaces de unirse mediante enlaces no covalentes a los residuos de monosacáridos u oligosacáridos presentes en la superficie celular. Las lectinas han sido ampliamente utilizadas en la clasificación de bacterias, protozoos y otros microorganismos. La aplicación de lectinas conjugadas con FITC junto con técnicas de epifluorescencia microscópica han permitido diferenciar entre especies de dinoflagelados morfológicamente similares.
También se ha empleado lectinas conjugadas con FITC para discernir entre diferentes cepas de microorganismos productores de toxinas. Se han empleado diferentes lectinas para reconocer cepas tóxicas de M. aeruginosa (Alvarez et al., 1998. En Reguera, B., Blanco, J., Fernández, M.L. y Wyatt, T. [Eds.] Harmful algae. pp. 291-5. Xunta de Galicia and Intergovernmental Oceanographic Commission of UNESCO, París.), de Alexandrium tamarense (Cho et al., 2001. J. Plankton Res. 23: 89-95), o para reconocer cepas de Pseudonitzchia multiseries Hasle productoras de ácido domóico (Cho et al., 2002. Bot. Mar. 45: 346-72; y Cho, 2003. J. Plankton Res. 25: 309-15.). Recientemente, Hou y colaboradores (2008. J. Appl. Phycol. 20: 35-46) han empleado lectinas para reconocer 23 cepas productoras de toxinas de 13 especies diferentes y típicamente problemáticas en aguas de China, incluyendo Alexandrium tamarense, A. catenella, A. minutum, Karenia mikimotoi, Takayama pulchellum, Akashiwo sanguínea, Gyrodinium instriatum, Gymnodinium sp, Prorocentrum donghaiense, y P. minimum.
Cabe destacar que una de las conclusiones más importantes de los trabajos citados es que, aunque el reconocimiento de dinoflagelados tóxicos mediante lectinas es un método sencillo y rápido, la variabilidad genética de las distintas especies puede provocar problemas de falso reconocimiento y discriminación (ver, por ejemplo, Hou et al., 2008. J. Appl. Phycol. 20: 35-46). Por este motivo es necesario obtener lectinas que permitan superar el problema y discernir con total garantía y fiabilidad entre cepas productoras de toxinas y cepas no productoras, de forma que pueda implantarse su empleo rutinario en los sistemas de control y alerta temprana de calidad de agua.
Teniendo en cuenta que M. aeruginosa aparece implicada en la mayoría de episodios tóxicos de proliferaciones de cianobacterias a escala mundial, y que se caracteriza por una gran variabilidad genética respecto a la producción de microcistina, resulta especialmente necesario e interesante la obtención de una lectina que permita reconocer y discernir inequívocamente entre cepas tóxicas de M. aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M. aeruginosa no productoras de microcistina.
La presente invención tiene por objeto principal proporcionar un kit basado en una lectina que permite reconocer y discernir inequívocamente entre cepas tóxicas de M. aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M. aeruginosa no productoras de microcistina. También se reivindica el método basado en dicho kit por el que se puede reconocer y discernir inequívocamente entre cepas tóxicas de M. aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M. aeruginosa no productoras de microcistina. Se trata de un procedimiento fiable, rápido y de sencillo desarrollo, de implantación idónea en los sistemas de red de alerta temprana en embalses de abastecimiento urbano y sistemas de control de aguas de abastecimiento de ganado y aguas refugio de fauna silvestre.
Descripción de la invención
La presente invención se basa en el hallazgo inesperado de que la lectina Aglutinina 1 de Ulex europaeus (UEA-I) es capaz de reconocer y discriminar inequívocamente entre cepas de Microcystis aeruginosa productoras de microcistina de las no productoras.
Los inventores han observado que la lectina UEA-I se une a la superficie celular de las cepas de M. aeruginosa no productoras de microcistina investigadas, y no se une a las cepas de M. aeruginosa productoras de microcistina. Sin querer estar vinculado por ninguna teoría, se piensa que hay un ligamiento entre los genes que codifican las glicoproteínas transmembrana diana de la lectina UEA-I y los genes que codifican microcistinas en M. aeruginosa, lo que garantiza que la presencia de la glicoproteína diana de la lectina UEA-I en la superficie celular de M. aeruginosa, y por tanto, su reconocimiento y unión por UEA-I, es incompatible con la producción de microcistina en M. aeruginosa.
...
Reivindicaciones:
1. Kit para el reconocimiento y discriminación de cepas tóxicas de M. aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M. aeruginosa no productoras de microcistina que comprende:
2. Kit según la reivindicación 1 en el que la sonda es fluorescente.
3. Kit según la reivindicación 2 en el que la sonda es Isotiocianato de Fluoresceína (FITC).
4. Kit según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los medios para poner en contacto la muestra con la lectina UEA-I comprenden un recipiente y una solución PBS.
5. Kit según la reivindicación 4 caracterizado porque el recipiente es un tubo de ensayo, un microtubo, un microtubo del tipo Eppendorf, o uno, o varios pocillos de una placa multipocillos.
6. Kit según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la concentración de lectina UEA-I se encuentra entre 1 y 1000 microgramos de lectina por mililitro de solución que contiene la muestra.
7. Kit según la reivindicación 6, caracterizado porque la concentración de lectina UEA-I se encuentra entre 50 y 500 microgramos de lectina por mililitro de solución que contiene la muestra.
8. Kit según la reivindicación 7, caracterizado porque la concentración de lectina UEA-I se encuentra entre 95 y 105 microgramos de lectina por mililitro de solución que contiene la muestra.
9. Método para el reconocimiento y discriminación de cepas tóxicas de M. aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M. aeruginosa no productoras de microcistina que comprende:
10. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque la concentración de lectina UEA-I se encuentra entre 1 y 1000 microgramos de lectina por mililitro de solución que contiene la muestra.
11. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque la concentración de lectina UEA-I se encuentra entre 50 y 500 microgramos de lectina por mililitro de solución que contiene la muestra.
12. Método según la reivindicación 10 caracterizado porque la concentración de lectina UEA-I se encuentra entre 95 y 105 microgramos de lectina por mililitro de solución que contiene la muestra.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque la sonda específica de la lectina UEA-I es fluorescente.
14. Método según la reivindicación 13, caracterizado porque la sonda específica de la lectina UEA-I es Isotiocianato de Fluoresceína (FITC).
15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, caracterizado porque los medios para poner en contacto la muestra con la lectina UEA-I comprenden un recipiente y una solución PBS.
16. Método según la reivindicación 15, caracterizado porque el recipiente es un tubo de ensayo, un microtubo, un microtubo del tipo Eppendorf, o uno, o varios pocillos de una placa multipocillos.
17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16, que incluye una etapa de homogeneización y acondicionamiento de la muestra, previa a poner en contacto dicha muestra con la lectina UEA-I y con una sonda específica de dicha lectina UEA-I, comprendiendo dicha etapa de homogeneización y acondicionamiento la centrifugación de la muestra y su resuspensión en una solución PBS.
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