Nueva proteína y proceso para producir la misma.

LA INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVA PROTEINA QUE SE UNE AL FACTOR INHIBIDOR DE LA OSTEOCLASTOGENESIS (MOLECULA QUE SE UNE A OCIF;

OBM), A UN PROCEDIMIENTO DE PREPARACION DE LA MISMA, AL ADN QUE CODIFICA PARA LA MISMA, A UNA PROTEINA QUE TIENE LA SECUENCIA AMINOACIDA CODIFICADA POR DICHO ADN, A UN PROCEDIMIENTO DE PRODUCCION DE DICHA PROTEINA MEDIANTE INGENIERIA GENETICA, Y A UNA COMPOSICION FARMACEUTICA QUE CONTIENE DICHA PROTEINA. SE PRESENTAN TAMBIEN PROCEDIMIENTOS DE SELECCION PARA UNA SUSTANCIA DESTINADA A CONTROLAR LA EXPRESION DE DICHA PROTEINA, UTILIZANDO DICHA PROTEINA Y EL ADN, UNA SUSTANCIA QUE INHIBE O MODULA LA ACTIVIDAD BIOLOGICA DE DICHA PROTEINA, O UN RECEPTOR QUE TRANSMITE LA ACCION DE DICHA PROTEINA MEDIANTE SU UNION A DICHA PROTEINA. ASIMISMO, SE PROPORCIONA LA SUSTANCIA OBTENIDA MEDIANTE DICHO PROCEDIMIENTO DE SELECCION Y UNA COMPOSICION FARMACEUTICA QUE CONTIENE DICHA SUSTANCIA. POR ULTIMO, LA INVENCION SUMINISTRA UN ANTICUERPO PARA DICHA PROTEINA, UN PROCEDIMIENTO DE PREPARACION DEL MISMO, UN PROCEDIMIENTO DE MEDICION DE DICHA PROTEINA UTILIZANDO DICHO ANTICUERPO Y UNA MEDICINA QUE COMPRENDE EL CITADO ANTICUERPO.

Nueva proteína y proceso para producir la misma Campo de Tecnología La presente invención se refiere al uso de un anticuerpo para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una disminución de la masa ósea debida a anormalidad del metabolismo óseo.

Antecedentes de la Técnica El metabolismo óseo depende de la actividad global de los osteoblastos que controlan la formación de hueso y los osteoclastos que controlan la resorción ósea. La anormalidad del metabolismo óseo se considera que está causada por un desequilibrio de la formación de hueso y la resorción ósea. Osteoporosis, hipercalcemia, enfermedad de Paget, osteodistrofia renal, artritis reumatoide, osteoartritis, y análogas son conocidas como enfermedades que acompañan a la anormalidad del metabolismo óseo. La osteoporosis es una enfermedad típica causada por dicha anormalidad del metabolismo óseo. Esta enfermedad se genera cuando la resorción ósea por los osteoclastos excede a la formación de hueso por los osteoblastos. La enfermedad se caracteriza por una disminución tanto en el material óseo calcificado como en la matriz ósea. Aunque el mecanismo de esta enfermedad no se ha dilucidado por completo, la enfermedad causa dolencias en los huesos, los hace frágiles, y puede dar como resultado fracturas. Esta enfermedad está convirtiéndose en un problema social debido que aumenta el número de personas ancianas postradas en cama a medida que se hace mayor la población de ancianos. El desarrollo de agentes terapéuticos para esta enfermedad es urgentemente deseado. La enfermedad con una disminución de masa ósea debida a la anormalidad del metabolismo óseo se espera que se cure por supresión de la resorción ósea, aceleración de la formación de hueso, o mejora del balance entre la resorción y la formación óseas. La formación de hueso se espera que aumente por aceleración de la proliferación, diferenciación, o activación de los osteoblastos que forman hueso,

o por supresión de la proliferación, diferenciación de osteoclastos a partir de pre–osteoclastos o de la activación de osteoclastos que reabsorben hueso. En los últimos años, se ha dirigido un gran interés hacia hormonas, sustancias de peso molecular bajo, o proteínas fisiológicamente activas que exhiben dichas actividades, y se encuentran en curso investigación y desarrollo básicos intensos acerca de estas materias.

Fármacos tales como agentes de calcitonina, agentes de vitamina D3 de forma activa, agentes hormonales que contienen estradiol, ipriflavona, vitamina K2, y compuestos de bisfosfonato se han dado ya a conocer como fármacos para tratar y acortar el periodo de tratamiento de las enfermedades relacionadas con los huesos. Se encuentran en progreso ensayos clínicos sobre derivados de vitamina D3 de forma activa, derivados de estradiol, y compuestos de bisfosfonato de la segunda y tercera generaciones para desarrollar agentes terapéuticos con eficacia excelente y efectos secundarios mínimos.

Sin embargo, las terapias que utilizan estos agentes no han resultado necesariamente satisfactorias en términos de eficacia y resultados terapéuticos. El desarrollo de nuevos agentes terapéuticos que sean más seguros y más eficientes se desea urgentemente. Algunos agentes utilizados para el tratamiento de enfermedades relacionadas con el metabolismo óseo se utilizan sólo de modo limitado debido a sus efectos secundarios. Adicionalmente, los tratamientos que utilizan dos o más agentes en combinación son actualmente la corriente principal en el tratamiento de las enfermedades relacionadas con el metabolismo óseo tales como la osteoporosis. Desde dicho punto de vista, es deseable el desarrollo de fármacos que tengan mecanismos de acción diferentes de los de los fármacos convencionales, y que exhiban una mayor eficacia y efectos secundarios mínimos.

Como se ha mencionado arriba, las células que controlan el metabolismo óseo son osteoblastos y osteoclastos. Se sabe que estas células ejercen interacciones íntimas mutuas denominadas "acoplamiento". Específicamente, se sabe que citoquinas tales como las Interleuquinas 1 (IL–1) , 3 (IL–3) , 6 (IL–6) , y 11 (IL–11) , el factor estimulante de colonias de macrófagos granulocíticos (GM–CSF) , el factor estimulante de colonias de macrófagos (M–CSF) , el interferón–y (IFN–y) , el factor de necrosis de tumores a (TNF–a) , y el factor del crecimiento transformante–1 (TGF– 1) , secretados por las células estromales osteoblásticas aceleran o suprimen la diferenciación o maduración de los osteoclastos (Raisz: Disorders of Bone and Mineral Metabolism, 287–311, 1992; Suda et al.: Principles of Bone Biology, 87–102, 1996; Suda et al.: Endocrine Reviews, 4, 266–270, 1995; Lacey et al.: Endocrinology 186, 2369– 2376, 1995) . Se ha informado que las células osteoblásticas estromales juegan un papel importante en la diferenciación y maduración de los osteoclastos, así como en funciones de los osteoclastos tales como la resorción ósea por los osteoclastos maduros, a través del contacto célula–célula con precursores inmaduros de osteoclastos u osteoclastos maduros.

Se cree que un factor denominado factor de diferenciación de los osteoclastos (ODF, Suda et al.: Endocrine Rev. 13, 66–80, 1992; Suda et al.: Bone 17, 87S–91S, 1995) es expresado en la membrana de las células osteoblásticas estromales y está implicado en la formación de osteoclastos por contacto célula–célula. De acuerdo con esta hipótesis, un receptor ODF está presente en las células precursoras de los osteoclastos. Sin embargo, hasta ahora ni el ODF ni el receptor han sido purificados o identificados. No existen tampoco informes relacionados con sus características, mecanismo de acción, o estructura. Así pues, el mecanismo implicado en la diferenciación y maduración de los osteoclastos no ha sido suficientemente esclarecido hasta ahora. La clarificación de este mecanismo contribuirá notablemente no sólo a la medicina básica, sino también al desarrollo de nuevos fármacos para el tratamiento de las enfermedades asociadas con la anormalidad del metabolismo óseo.

Anderson D.M. et al.: "A homologue of the TNF receptor and its ligand enhance T–cell growth and dendritic–cell function", Natura, MacMillan Journale Ltd. Londres, GB, vol. 390, no. 6656, 13 de noviembre de 1997 (1997–11–13) , páginas 175–179, es un documento publicado posteriormente que describe proteínas de la superfamilia de receptores de TNF.

Simonet W.S. et al.: "Osteoprotegerin: A novel secreted protein involved in the regulation of bone density." Cell, vol. 89, no. 2, 1997, páginas 309–319 es un documento post–publicado y describe la proteína OPG.

Smith C.A. et al.: "The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins: activation, co–estimulation and death", Cell, Cell Press, Cambridge, NA. EE.UU., vol. 76, 25 de marzo de 1994 (1994–03–25) , páginas 959–962 describe proteínas de la superfamilia de los receptores de TNF.

El documento EP–A–0 784 093, un documento de la técnica anterior de acuerdo con Art. 54 (3) EPC, describe la proteína OPG.

Los autores de la presente invención han realizado estudios extensos teniendo presente esta situación y han descubierto un factor inhibidor de la osteoclastogenesis (OCIF) en un caldo de cultivo de fibroblastos de pulmón en el embrión humano, IMR–90 (ATCC, No. de Depósito CCL186) (documento WO 96/26217) .

Los autores de la presente invención han tenido éxito en la clonación de DNA codificante de OCIF, la producción de OCIF recombinante en células animales, y la confirmación de efectos farmacéuticos in vivo (efecto mejorador del metabolismo óseo, etc.) del OCIF recombinante. Se espera que OCIF llegue a utilizarse como agente para la prevención o el tratamiento de enfermedades relacionadas con anormalidades del metabolismo óseo, con mayor eficacia que los fármacos convencionales y menos efectos secundarios.

Los autores de la presente invención han buscado una proteína que se fije al factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF) y han descubierto que una proteína de fijación de OCIF (OBM) se expresa específicamente en las células osteoblásticas estromales cultivadas en presencia de un factor estimulante del factor de resorción ósea tal como la vitamina D3 de forma activa y la hormona paratiroidea (PTH) . Adicionalmente, Los autores de la presente invención han investigado las características y las funciones fisiológicas de esta proteína que se fija a OCIF y han encontrado que la proteína exhibe la actividad biológica de un factor que soporta o promueve... [Seguir leyendo]

1. Uso de un anticuerpo para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una disminución de la masa ósea debida a anormalidad del metabolismo óseo, anticuerpo que está dirigido contra una proteína como componente activo, proteína que tiene las características fisicoquímicas y la actividad biológica siguientes:

(a) afinidad: se fija específicamente al factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF) y exhibe afinidad alta a OCIF con una constante de disociación en la membrana celular: Kd = 10–9 M o menos;

(b) peso molecular: tiene un peso molecular de 30.000–40.000 cuando se mide utilizando electroforesis en gel de SDS–poliacrilamida en condiciones no reductoras y un peso molecular aparente de 90.000–110.000 cuando está reticulada a un OCIF de tipo monómero; y

(c) actividad biológica: exhibe actividad de soporte o promoción de la diferenciación y maduración de los osteoclastos en un sistema de co–cultivo de las células osteoblásticas estromales y células del bazo en presencia de factores estimulantes de la resorción ósea tales como vitamina D3 de forma activa y hormona paratiroidea

(PTH) .

2. Uso de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la anormalidad del metabolismo óseo es una enfermedad seleccionada del grupo constituido por osteoporosis, hipercalcemia, enfermedad de Paget, osteodistrofia renal, artritis reumatoide y osteoartritis.

DÍAS

FIJACIÓN DE OCIF MARCADO CON 125I (cpm)

ACTIVIDAD TRAP (405 nm)

FIJACIÓN DE 125I-OCIF (CPM X 10-3)

CONCENTRACIÓN DE OBM O sOBM DE RATÓN (pmol/ml x 10-3)