Nueva proteína galectina 9 modificada y uso de la misma.

Una proteína, o una sal de la misma, que comprende una proteína galectina 9 mutante que tiene actividad deunión a β

-galactósido y que tiene la estructura (N-CRD)-Engarce-(C-CRD), en la que

N-CRD es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3, una variante de la misma quedifiere de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3 en una deleción, sustitución o adición de 1 a 8 restos deaminoácidos y que tiene actividad polipeptídica sustancialmente equivalente a SEC ID Nº: 3, o una variante delmismo que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 70% homóloga de SEC ID Nº: 3 y que tiene actividadpolipeptídica sustancialmente equivalente a SEC ID Nº: 3;

C-CRD es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4, una variante del mismo que difierede la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4 en una deleción, sustitución o adición de 1 a 21 restos deaminoácidos y que tiene actividad polipeptídica sustancialmente equivalente a SEC ID Nº: 4, o una variante delmismo que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 70% homóloga de SEC ID Nº: 4 y que tiene actividadpolipeptídica sustancialmente equivalente a SEC ID Nº: 4; y

Engarce es una secuencia de aminoácidos que consiste en 2 restos de aminoácidos arbitrarios, o que tiene lasecuencia Arg Ile Pro.

Nueva proteína galectina 9 modificada y uso de la misma Campo de la invención La presente invención se refiere a nuevas proteínas galectina 9 modificadas (muteínas de galectina 9) y aplicaciones de las mismas. Particularmente, la presente invención se refiere a proteínas galectina 9 mutantes funcionales en las que dicha proteína galectina 9 mutante funcional tiene una región peptídica de enlace modificada, y a sus aplicaciones prácticas en bioquímica, diagnósticos médicos, terapia y farmacología.

Antecedentes de la invención Se han encontrado pruebas que indican el siguiente hecho: las cadenas de sacáridos específicas y proteínas que se unen a las mismas desempeñan muchos papeles y funciones diversos en fenómenos fisiológicos, acontecimientos asociados con el desarrollo/crecimiento y una diversidad de enfermedades en los cuerpos vivos de mamíferos. Se ha descubierto que hay lectinas animales, en cuerpos vivos, que reconocen específicamente cadenas de sacáridos con estructura de ! galactósido. Hasta ahora se han identificado al menos 14 tipos de genes para galectinas que pertenecen al grupo de tales lectinas. Aunque la familia de galectina está clasificada, basándose en su estructura, en tres subgrupos, es decir, grupos prototipo, quimera y de repeticiones en tándem, las funciones in vivo apenas se han desvelado. Particularmente, el estudio de las galectinas de tipo repetición en tándem que conservan dos dominios de reconocimiento de carbohidratos tiene solamente un historial corto. Puesto que aún no se han revelado cadenas de sacáridos in vivo (receptores) para marcarse como objetivos, las funciones aún no se han aclarado. A partir de detalles incluyendo cómo se encontraron galectinas cuando se realizó una búsqueda de proteínas que reconocieran cadenas de azúcares complicadas en la superficie de las células, se ha predicho que estas tienen funciones tales como la implicación en adhesión celular, comunicación de célula a célula, activación celular.

Por lo tanto, las galectinas han atraído atención. Además, se están obteniendo resultados de investigación que anticipan lo siguiente: las galectinas conservan, además de tales funciones, una diversidad de otras funciones importantes. La galectina 9, una de las galectinas de tipo repetición en tándem, se identificó en primer lugar como un autoantígeno en paciente con enfermedad de Hodgkin (Documentos No de Patente 1 y 2) , y se ha conjeturado que desempeñan un papel importante en interacciones de célula a célula entre células inmunitarias. Se clonó galectina 9 de ratón de la biblioteca de ADN de riñón de ratón por PCR 5’-RACE con cebadores degenerados que se diseñaron basándose en secuencias que se consideraba que eran altamente conservativas entre los dominios de reconocimiento de carbohidratos de galectinas (Documento No de Patente 3) . Se ha descubierto que los linfocitos T estimulados con antígenos producen in vivo e in vitro un quimioatrayente de eosinófilos, es decir, ecalectina.

Además, aunque la ecalectina es estructuralmente diferente de otros quimioatrayentes de eosinófilos conocidos hasta la fecha, tiene afinidad de unión a azúcares por las cadenas de sacáridos de ! galactósico, por lo que puede clasificarse en la familia de galectinas. La clonación de ecalectina ha sido un éxito a partir de ARNm obtenido de líneas celulares de leucemia derivadas de linfocitos T humanas. Como resultado, se ha verificado que la ecalectina es una de las variantes de galectina 9, y la galectina 9 y ecalectina son sustancias idénticas (Documento No de Patente 4) .

Se ha indicado en la actualidad que la galectina 9 natural incluye galectina 9 de tipo L (isoforma larga de galectina 9

o galectina 9 de tipo largo: Gal-9L) , galectina 9 de tipo M (isoforma media de galectina 9 o galectina 9 de tipo medio: Gal-9M) y galectina 9 de tipo S (isoforma corta de galectina 9 o galectina 9 de tipo corto: Gal-9S) . Cualquiera de los miembros de galectina 9 es una molécula que consiste en dos dominios de reconocimiento de carbohidratos (CRD) y un péptido de engarce que es una región de enlace entre dos CRD. La galectina 9 de tipo L es una molécula con la región peptídica de enlace más larga en la que el dominio N terminal (NCRD) está ligado al dominio C terminal (CCRD) con la ayuda de dicha región peptídica de enlace mientras que la galectina 9 de tipo S es una molécula con la región peptídica de enlace más corta. La galectina 9 tipo M es una molécula con una región peptídica de enlace de longitud media en comparación con ambas, y se sabe que en general Gal-9M existe predominantemente en tejido y células corporales a diferencia de las dos anteriores. Además, puede percibirse que hay algunas pruebas que indican la presencia de polimorfismo genético entre los genes de galectina 9 clonados a partir de células y tejido humanos.

La galectina 9 natural consiste en dos dominios de reconocimiento de carbohidratos (CRD) y una región de enlace que es un enlace entre dichos CRD. Se ha sugerido que la galectina 9 recombinante, producida en E. coli huésped, induce la inhibición de metástasis de cáncer y regresión de cánceres por acciones directas sobre las células tumorales (actividad de inducción de la adhesión intercelular y apoptosis de células tumorales) y acciones mediante el sistema inmunitario. Se ha revelado que la galectina 9 no actúa en linfocitos no activados mientras que induce apoptosis de linfocitos activados, entre otros linfocitos T positivos para CD4 que provocarán reacción hiperinmune. También se ha desvelado que la galectina 9 tiene una propiedad inductora de apoptosis potente de actuación sobre las células sinoviales implicadas en una deformidad de las articulaciones u otros síntomas de reumatismo. [Documento No de Patente 1] Sahin, U. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 11810-11813 (1995) [Documento No de Patente 2] Türeci, O. y col., J. Biol. Chem., 272 (10) , 6416-6422 (1997)

[Documento No de Patente 3] Wada, J. y col., J. Biol. Chem., 272 (9) , 6078-6086 (1997)

[Documento No de Patente 4] Matsumoto, R. y col., J. Biol. Chem., 273 (27) , 16976-16984 (1998)

Sumario de la invención Se espera que la utilización de tales propiedades versátiles poseídas por galectina 9 augure técnicas terapéuticas para cánceres, enfermedades autoinmunes refractarias (incluyendo reumatismo) y trastornos alérgicos. Sin embargo, la galectina 9 recombinante (rGal9) tiene un área de enlace susceptible a proteasa conectando dicha área de enlace dos CRD, y es por lo tanto fácilmente digerible con enzimas proteolíticas. La escisión proteolítica de rGal 9 dará como resultado pérdida de la actividad anteriormente mencionada.

Los presentes inventores han realizado una búsqueda exhaustiva en diversas moléculas para resolver los problemas anteriores. Como resultado, los presentes inventores han tenido éxito en la producción de nuevas moléculas que tienen una estructura molecular más estable frente a la acción de proteasa mientras que la actividad de reconocimiento de carbohidratos de galectina 9 natural se conserva. Los presentes inventores han tenido éxito en la construcción de moléculas modificadas altamente estabilizadas sin afectar de forma adversa a la actividad anteriormente mencionada teniendo dicha molécula un área de enlace de Gal 9 alterada que enlaza dos CRD de Gal

9. Por lo tanto, se ha conseguido la presente invención.

La presente invención proporciona lo siguiente:

(1) Una proteína, o una sal de la misma, que comprende una proteína galectina 9 mutante que tiene actividad de unión a ! galactósido y que tiene la estructura (N-CRD) -Engarce- (C-CRD) , en la que N-CRD es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 3, una variante de la misma que difiere de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3 por una deleción, sustitución o adición de 1 a 8 restos de aminoácidos y que tiene la actividad sustancialmente equivalente a la del polipéptido de SEC ID Nº: 3, o una variante de la misma que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 70% homóloga de SEC ID Nº: 3 y que tiene actividad sustancialmente equivalente a la del polipéptido de SEC ID Nº: 3; C-CRD es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4, una variante de la misma que difiere de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4 por una deleción, sustitución o adición de 1 a 21 restos de aminoácidos y que tiene actividad sustancialmente equivalente a la del polipéptido de SEC ID Nº: 4, o una variante de la misma que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 70% homóloga de SEC ID Nº: 4 y que tiene actividad sustancialmente equivalente a la del polipéptido de SEC ID Nº: 4; y el engarce es una secuencia de... [Seguir leyendo]

1. Una proteína, o una sal de la misma, que comprende una proteína galectina 9 mutante que tiene actividad de unión a !-galactósido y que tiene la estructura (N-CRD) -Engarce- (C-CRD) , en la que N-CRD es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3, una variante de la misma que difiere de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3 en una deleción, sustitución o adición de 1 a 8 restos de aminoácidos y que tiene actividad polipeptídica sustancialmente equivalente a SEC ID Nº: 3, o una variante del mismo que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 70% homóloga de SEC ID Nº: 3 y que tiene actividad polipeptídica sustancialmente equivalente a SEC ID Nº: 3; C-CRD es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4, una variante del mismo que difiere de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4 en una deleción, sustitución o adición de 1 a 21 restos de aminoácidos y que tiene actividad polipeptídica sustancialmente equivalente a SEC ID Nº: 4, o una variante del mismo que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 70% homóloga de SEC ID Nº: 4 y que tiene actividad polipeptídica sustancialmente equivalente a SEC ID Nº: 4; y Engarce es una secuencia de aminoácidos que consiste en 2 restos de aminoácidos arbitrarios, o que tiene la secuencia Arg Ile Pro.

2. La proteína o sal de la misma de la reivindicación 1, en la que el Engarce es un polipéptido que tiene la secuencia His Met o Arg Ile Pro.

3. La proteína o sal de la misma de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 2.

4. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, siendo dicha molécula un polinucleótido.

6. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, siendo dicha molécula ADN o ARN.

7. Un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

8. El vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 7 comprendiendo dicho vector una secuencia de nucleótidos que codifica un marcador proteico y/o un marcador peptídico en combinación con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

9. Una célula transformada o transfectada que porta la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 o el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 7 u 8.

10. La célula transformada o transfectada de acuerdo con la reivindicación 9, siendo dicha célula huésped procariota

o eucariota.

11. Un fármaco que comprende una cantidad eficaz de al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en la proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, y la célula transformada o transfectada de acuerdo con la reivindicación 9 o 10.

12. El fármaco de acuerdo con la reivindicación 11 que es un inmunorregulador o inmunomodulador.

13. El fármaco de acuerdo con la reivindicación 11 que es un agente antineoplásico o antitumoral.

14. Un reactivo de ensayo o prueba que comprende una cantidad eficaz de al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en la proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 y la célula transformada o transfectada de acuerdo con la reivindicación 9 o 10.