Eotaxina = citocina quimiotáctica de eosinófilos.

SE PRESENTA UNA PROTEINA QUIMIOATRAYENTE LLAMADA "EOTAXINA" QUE ES CAPAZ DE ATRAER EOSINOFILOS Y DE INDUCIR LA ACUMULACION DE EOSINOFILOS Y/O LA ACTIVACION IN VITRO E IN VIVO.

DIFERENTES TIPOS DE AGENTES QUE INHIBEN O DE OTRA FORMA ESTORBAN LA PRODUCCION, LIBERACION O ACTIVIDAD DE LA EOTAXINA PUEDEN UTILIZARSE TERAPEUTICAMENTE EN EL TRATAMIENTO DEL ASMA Y OTRAS ENFERMEDADES INFLAMATORIAS.

Eotaxina = citocina quimiotáctica de eosinófilos.

La presente invención se refiere a una citocina quimiotáctica.

La acumulación de leucocitos eosinófilos es una propiedad característica de las reacciones alérgicas mediadas por IgE tales como el asma alérgica, la rinitis y el eccema. La acumulación eosinófila también se produce en el asma no alérgica. La broncoconstricción inmediata en respuesta a un estímulo de provocación en el asmático implica la activación de los mastocitos y la liberación de mediadores constrictores. Esto va acompañado después de varias horas en algunos individuos por una respuesta broncoconstrictora tardía asociada a una entrada masiva de eosinófilos (1) . La provocación repetida produce la inflamación crónica en las vías respiratorias y una hipersensibilidad notable a los mediadores constrictores. La magnitud tanto de la respuesta tardía como de la hipersensibilidad crónica se correlaciona con el número de eosinófilos presentes en los pulmones (2, 3) .

La presente invención proporciona una proteína quimioatrayente susceptible de atraer a los eosinófilos y de provocar la acumulación eosinófila in vitro e in vivo. La proteína quimioatrayente de la presente invención se denomina “eotaxina”.

Con mayor detalle, según un aspecto de la presente invención, se proporciona una proteína quimioatrayente aislada capaz de atraer los eosinófilos y de producir acumulación eosinófila in vitro e in vivo y que no presenta sustancialmente ningún efecto atractivo para los neutrófilos in vivo, que consiste en una secuencia de aminoácidos o que comprende la misma tal como se expone en la SEC. ID nº: 1, o un fragmento de dicha proteína quimiatrayente que conserva sus actividades biológicas.

Las eotaxinas son proteínas del ramal C-C de la superfamilia del factor 4 de plaquetas de citocinas quimiotácticas. Dentro del ramal C-C de la superfamilia del factor 4 de plaquetas de las citocinas quimiotácticas o quimiocinas, algunos miembros tienen la propiedad de atraer los eosinófilos in vitro y algunos pueden producir la acumulación eosinófila in vivo. Por ejemplo, las quimiocinas RANTES y MIP-1a atraen a los eosinófilos in vitro mientras que MCP1 y MIP-1º no. (“RANTES” significa Reguladas en la Activación en linfocitos T Normales Expresados y Segregados, “MIP” significa Proteína Inflamatoria del Macrófago y “MCP” significa Proteína Quimioatrayente de Monocitos)

Las citocinas naturales en la superfamilia del factor 4 de plaquetas de las citocinas quimiotácticas pueden presentar variaciones interespecies notables en la longitud de la molécula de la proteína, en la secuencia de aminoácidos de la proteína, y en las modificaciones del carbohidrato de la proteína, mientras que se conservan las mismas propiedades funcionales características. Similares variaciones en la estructura pueden producirse en las citocinas obtenidas a partir de diferentes individuos dentro de la misma especie. Muchas quimiocinas dentro del ramal C-C de la superfamilia del factor 4 de plaquetas presentan promiscuidad de la fijación del receptor, y la capacidad de las diferentes quimiocinas para fijarse al mismo receptor no depende necesariamente del alto grado de homología a nivel de aminoácidos. Por consiguiente, tanto las variaciones interespecie como intraespecie en la longitud de las proteínas, la secuencia de aminoácidos y en las modificaciones del carbohidrato son de esperar generalmente en las eotaxinas.

La aptitud para atraer eosinófilos y para producir la acumulación eosinófila y/o la activación in vitro e in vivo es una propiedad característica de las eotaxinas. Además, las eotaxinas generalmente no presentan sustancialmente ningún efecto atractivo para los neutrófilos in vivo. El efecto quimioatrayente eosinófilo puede ser un efecto entre las especies, por ejemplo, la eotaxina del cobaya parece ser potente para producir quimiotaxia de los eosinófilos humanos in vitro.

Aunque no forme parte de la invención, puede obtenerse una eotaxina a partir de un fluido corporal apropiado, por ejemplo, del fluido del lavado broncoalveolar obtenido de un ser humano o de un individuo no humano, particularmente un individuo alérgico después de una prueba de provocación con alérgeno, ya sea provocada experimentalmente o contraída de forma natural. Otras fuentes de eotaxinas son, por ejemplo, los fluidos del exudado inflamatorio y los cultivos in vitro de macrófagos, linfocitos, neutrófilos, mastocitos, células epiteliales de las vías respiratorias, células de tejido conectivo, células endoteliales vasculares y los propios eosinófilos.

Por ejemplo, una eotaxina puede obtenerse a partir de un cobaya sensibilizado tras la prueba de provocación con alérgeno. Los modelos de cobaya son útiles ya que comparten muchas propiedades comunes con la respuesta asmática en el hombre. La eotaxina que puede obtenerse del fluido del lavado broncoalveolar de un cobaya sensibilizado mediante purificación sucesiva por HPLC presenta generalmente un peso molecular comprendido en el intervalo entre 6 y 16 kDa. (Como se indicó anteriormente, las variaciones del peso molecular intraespecie de este orden de magnitud se observan en los miembros de la superfamilia del factor 4 de plaquetas) .

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para la producción de una proteína quimioatrayente de la presente invención, que comprende el cultivo in vitro de macrófagos, linfocitos, neutrófilos, mastocitos, células epiteliales de las vías respiratorias, células de tejido conectivo, y el aislamiento de las células o del fluido del cultivo celular de una fracción que demuestra la actividad quimiotáctica eosinófila in vitro e in vivo y que no presenta sustancialmente ningún efecto atractivo para los neutrófilos in vivo.

La secuencia de aminoácidos de la eotaxina del cobaya esta expuesta en la SEC. ID nº: 1, SEC. ID nº: 2 y en las Figuras 7 y 8 de los dibujos adjuntos. Otras eotaxinas de cobaya generalmente tendrán por lo menos el 40 o el 50% de homología total con el listado de secuencias presentado en la SEC. ID nº: 1 (Figura 7) a nivel de aminoácidos. La homología puede ser por lo menos del 60%, por ejemplo por lo menos del 70%, por ejemplo por lo menos del 80% con la secuencia expuesta en la SEC. ID nº: 1 y en la Figura 7.

El porcentaje de homología en el presente caso se calcula sobre la base de los aminoácidos que son idénticos en las posiciones correspondientes en las dos secuencias en investigación. Las sustituciones conservadoras no se tienen en cuenta. En el cálculo del porcentaje de homología de una supuesta molécula de eotaxina en investigación con la secuencia mostrada en la SEC. ID nº: 1 (Figura 7) o con la SEC. ID nº: 2 (Figura 8) si la molécula en investigación presenta una longitud diferente de la eotaxina expuesta en la SEC. ID nº: 1 o en la SEC. ID nº: 2 (Figura 7 o Figura 8) , entonces el cálculo se basa en los aminoácidos en la parte de la molécula en investigación que se solapan con la secuencia mostrada en la SEC. ID nº: 1 (Figura 7) o en la SEC. ID nº: 2 (Figura 8) . Los paquetes del programa informático para la alineación de las secuencias de aminoácidos y el cálculo de la homología están disponibles en el mercado, por ejemplo, el programa “Bestfit” disponible en Genetics Computer Group Sequence Analysis Software, Madison, Wisconsin, U.S.A.

A menos que se especifique de otro modo, los valores específicos del porcentaje de homología entre la eotaxina y otras citocinas quimiotácticas dadas en la presente memoria se han calculado basándose en la eotaxina expuesta en la SEC. ID nº: 1 (Figura 7) .

Como se indicó anteriormente, las eotaxinas que pueden obtenerse de otras especies aparte de los cobayas, por ejemplo de seres humanos, presentarán diferencias interespecie del tipo demostrado por otros miembros del ramal C-C de la superfamilia del factor 4 de plaquetas de quimiocinas, por ejemplo, diferencias en la longitud de la proteína, secuencia de aminoácidos y modificaciones de carbohidrato. Pueden, por ejemplo, existir variaciones en los restos de los terminales en C y/o N. Por ejemplo, es de esperar que el peso molecular de una eotaxina procedente de una especie distinta de cobaya esté comprendida en el intervalo entre 6 kDa y 16 kDa, pero en algunos casos una eotaxina puede tener un peso molecular inferior a 6 kDa o superior a 16 kDa.

Asimismo, es de esperar que en general una eotaxina de otra especie distinta del cobaya, presente por lo menos 40% de homología total con la secuencia expuesta en la SEC. ID nº: 1 y en la Figura 7. La homología puede ser de por lo menos 50%, por ejemplo de por lo menos 60%, por... [Seguir leyendo]

1. Proteína quimioatrayente aislada capaz de atraer eosinófilos y de inducir acumulación eosinófila in vitro e in vivo y que no presenta sustancialmente ningún efecto atractivo para los neutrófilos in vivo, que consiste en o que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en la SEC. ID nº: 1, o un fragmento de dicha proteína quimioatrayente que conserva sus actividades biológicas.

2. Proteína quimioatrayente según la reivindicación 1, que consiste en o que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se ha expuesto en la SEC. ID nº: 1. 10

3. Procedimiento para la producción de una proteína quimioatrayente según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende el cultivo in vitro de macrófagos, linfocitos, mastocitos, células epiteliales de las vías respiratorias o células de tejido conectivo, y el aislamiento de las células o del fluido del cultivo celular de una fracción que demuestra actividad quimioatrayente de eosinófilos in vitro e in vivo y que no presenta sustancialmente ningún efecto 15 atractivo para los neutrófilos in vivo.

4. Anticuerpo que se une específicamente a la proteína quimioatrayente según cualquiera de las reivindicaciones 1

o 2.

5. Anticuerpo según la reivindicación 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

6. Anticuerpo según la reivindicación 4 o 5, para su utilización como medicamento o en diagnóstico.

7. Utilización de un anticuerpo según la reivindicación 4 o 5, para la preparación de un medicamento destinado al 25 tratamiento del asma o de otra enfermedad inflamatoria.

8. Utilización según la reivindicación 7, para el tratamiento de la rinitis o del eccema.

9. Preparación farmacéutica que comprende, como principio activo, un anticuerpo según la reivindicación 4 o 5, 30 mezclado o junto con un vehículo farmacéuticamente adecuado.

10. Inmunoanálisis para un antígeno, caracterizado porque el antígeno es una proteína quimioatrayente según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

11. Inmunoanálisis para un anticuerpo, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo que forma un complejo con una proteína quimioatrayente según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

12. Método de ensayo de un compuesto para un efecto inhibidor sobre la actividad de una citocina quimioatrayente in vitro, caracterizado porque la citosina quimioatrayente es una proteína quimioatrayente según cualquiera de las 40 reivindicaciones 1 o 2.

13. Procedimiento para la preparación de un anticuerpo según la reivindicación 4 o 5, que comprende la utilización de una proteína quimioatrayente según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.