Un método para detectar células que expresan una primera proteína o ARN que comprende las etapas de:

(a) introducir en las células un primer constructo de ADN que codifica la primera proteína o ARN, en donde dicho primer transcrito de ARN o ARNm que codifica dicha primera proteína está asociado con una primera etiqueta epitópica que proporciona una única secuencia de ácido nucleico diana p 5 ara su reconocimiento por una baliza molecular;

(b) exponer dichas células a una primera baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN de dicha etiqueta epitópica; y

(c) detectar dichas células que muestran fluorescencia de dicha primera baliza molecular.

Selección y Aislamiento de Células Vivas Utilizando Sondas de Unión a ARN

Antecedentes de la Invención

Una baliza molecular es una sonda de ácido nucleico que reconoce e informa de la presencia de una secuencia de ácido nucleico específica. Las sondas son secuencias con forma de horquilla con un tramo central de nucleótidos complementario a la secuencia diana, y extremos que comprenden secuencias cortas mutuamente complementarias. Un extremo está unido covalentemente a un fluoróforo y el otro a un radical de extinción. Cuando está en su estado nativo con los extremos hibridados, la proximidad del fluoróforo y el extintor es tal que no se produce fluorescencia. La baliza experimenta un cambio conformacional fluorogénico espontáneo cuando se hibrida con su ácido nucleico diana. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 5.925.517.

Esta propiedad ha permitido a los investigadores detectar ácidos nucleicos específicos principalmente en reacciones in vitro y en algunos casos incluso en células vivas. Se ha logrado la visualización in situ del ARN mensajero utilizando balizas moleculares liberadas en las células vivas en liposomas (Matsuo, 1998, Biochim. Biophys. Acta 1379:178-184) . Los métodos que utilizan balizas moleculares difieren de los métodos anteriores tales como la detección de elementos de la cromatina específicos mediante asociación con genes informadores como describen Zahn-Zabal et al. (J. Biotechnol. 87:29-42 (2001) ) . Los estudios que implican células han empleado hasta la fecha balizas generadas con el fluoróforo muy débil EDANS ya que éste era el único que se sabía que era extinguido por el extintor EDAC. Los resultados aunque apreciables son escasos y así la aplicabilidad de esta línea de investigación a la detección in vivo no era prometedora.

Compendio de la Invención La presente invención proporciona particularmente un método para detectar células que expresan una primera proteína o ARN que comprende las etapas de:

(a) introducir en las células un primer constructo de ADN que codifica la primera proteína o ARN, donde dicho primer transcrito de ARN o ARNm que codifica dicha primera proteína está asociado con una primera etiqueta epitópica que proporciona una única secuencia de ácido nucleico diana para su reconocimiento por una baliza molecular;

(b) exponer dichas células a una primera baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN de dicha etiqueta epitópica; y

(c) detectar dichas células que muestran la fluorescencia de dicha primera baliza molecular.

También se describe en la presente memoria un método para generar una línea celular que expresa al menos una proteína preseleccionada que comprende las etapas de:

a) transfectar una línea celular con al menos un constructo de ADN que codifica al menos una proteína preseleccionada y al menos un marcador de resistencia a fármacos;

b) seleccionar las células resistentes a un fármaco al cual dicho marcador confiere resistencia, transcribiendo dichas células el al menos un marcador de resistencia a fármacos;

c) exponer las células seleccionadas a una primera baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación a un transcrito de ARN de la al menos una proteína preseleccionada;

d) aislar las células que emiten fluorescencia;

e) generar una línea celular que expresa la al menos una proteína preseleccionada haciendo crecer las células aisladas.

El método anteriormente mencionado se puede llevar a cabo utilizando la tecnología de clasificación de células activadas por fluorescencia. En un aspecto adicional, se puede elaborar la línea celular para expresar una segunda proteína preseleccionada llevando a cabo etapas adicionales incluyendo la transfección de la línea celular con un segundo constructo de ADN que codifica una segunda proteína preseleccionada y un segundo marcador de resistencia a un fármaco, la selección de las células que expresan el segundo marcador, la exposición de las células a una segunda baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación a un transcrito de ARN de la segunda proteína preseleccionada y el aislamiento de las células que emiten fluorescencia de cada uno de los al menos uno y el segundo transcritos de ARNm. Se pueden proporcionar líneas celulares que expresan más de dos proteínas repitiendo las etapas. El método para introducir la segunda proteína se puede realizar simultáneamente o secuencialmente. Si el primer y el segundo marcador de resistencia a fármacos son los mismos, se puede lograr la selección simultánea aumentando el nivel del fármaco.

También se describe en la presente memoria un método para generar una línea celular que expresa al menos una proteína preseleccionada que comprende las etapas de:

a) transfectar una línea celular con al menos un constructo de ADN que codifica al menos una proteína preseleccionada, al menos un marcador de resistencia a fármacos y al menos una primera etiqueta epitópica;

b) seleccionar las células resistentes a un fármaco al cual dicho marcador confiere resistencia, transcribiendo dichas células el al menos un marcador de resistencia a fármacos;

c) exponer las células a una primera baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN de la primera etiqueta epitópica;

d) aislar las células que emiten fluorescencia; y e) generar una línea celular que expresa la al menos una proteína preseleccionada haciendo crecer las células aisladas.

El método anteriormente mencionado se puede llevar a cabo utilizando la tecnología de clasificación de células activada por fluorescencia. La porción de ADN del constructo que codifica la etiqueta epitópica puede estar en marco o fuera del marco con la porción del constructo de ADN que codifica la al menos una proteína. En una realización adicional, se puede elaborar una línea celular para que exprese al menos una segunda proteína preseleccionada; incluyendo las etapas adicionales la transfección de la línea celular con un segundo constructo de ADN que codifica la segunda proteína preseleccionada, un segundo marcador de resistencia a fármacos y una segunda etiqueta epitópica, la selección de las células que transcriben el segundo marcador, la exposición de las células a una segunda baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN de la segunda etiqueta epitópica, y el aislamiento de las células que muestran fluorescencia de cada una de la primera y segunda etiquetas epitópicas. En el caso de las dos proteínas, la porción de la secuencia de ADN que codifica la segunda etiqueta epitópica también puede estar en marco o fuera del marco con la porción de la secuencia de ADN que codifica la segunda proteína. La segunda proteína preseleccionada se puede transfectar simultáneamente o secuencialmente con la primera. Se debe realizar el método simultáneamente, y utilizar el mismo marcador de resistencia a fármacos para ambos constructos, se puede utilizar un nivel superior de fármaco para seleccionar las células que expresan ambos constructos. Además, se pueden proporcionar más de dos proteínas en la línea celular repitiendo las etapas anteriormente mencionadas.

Además se describe en la presente memoria un método para generar una línea celular que expresa al menos una molécula de ARN antisentido preseleccionada que comprende las etapas de:

a) transfectar una línea celular con un constructo de ADN que codifica la al menos una molécula de ARN antisentido preseleccionada y al menos un gen de resistencia a fármacos;

b) seleccionar las células resistentes a un fármaco al cual confiere resistencia dicho marcador, transcribiendo dichas células el al menos un marcador de resistencia a fármacos;

c) exponer las células a una baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación a la molécula de ARN antisentido;

d) aislar las células que emiten fluorescencia; y e) generar una línea celular que expresa la secuencia de ARN antisentido preseleccionada haciendo crecer las células aisladas.

El aislamiento de las células que emiten fluorescencia se puede llevar a cabo utilizando la tecnología de clasificación de células activada por fluorescencia. Se puede elaborar una línea celular para que exprese al menos una segunda molécula de ARN antisentido preseleccionada, incluyendo las etapas adicionales de transfectar... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar células que expresan una primera proteína o ARN que comprende las etapas de:

(a) introducir en las células un primer constructo de ADN que codifica la primera proteína o ARN, en donde dicho primer transcrito de ARN o ARNm que codifica dicha primera proteína está asociado con una primera etiqueta epitópica que proporciona una única secuencia de ácido nucleico diana para su reconocimiento por una baliza molecular;

(b) exponer dichas células a una primera baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN de dicha etiqueta epitópica; y

(c) detectar dichas células que muestran fluorescencia de dicha primera baliza molecular.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente aislar las células detectadas.

3. El método de la reivindicación 2, en donde dichas células detectadas se aíslan utilizando la tecnología de clasificación celular activada por fluorescencia.

4. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la célula expresa una proteína localizada en la superficie celular o una proteína intracelular.

5. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la célula expresa un ARN seleccionado del grupo que consiste en ARN estructurales, ARN antisentido, ARNr, ARNhn, ARNsn y ARNm.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde se sospecha que dichas células expresan una segunda proteína o un segundo ARN, y el método comprende adicionalmente las etapas de exponer las células a una segunda baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con el segundo ARN o con un transcrito de ARNm que codifica la segunda proteína, y detectar las células que muestran fluorescencia de cada una de dichas primera y segunda balizas moleculares.

7. El método de la reivindicación 6, en donde dicha segunda proteína o ARN están asociados con una segunda etiqueta epitópica que proporciona una única secuencia de ácido nucleico diana para el reconocimiento por una baliza molecular, donde dicha segunda baliza molecular emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN de la segunda etiqueta epitópica.

8. El método de la reivindicación 6 o 7, en donde la primera proteína o ARN y la segunda proteína o ARN son los mismos.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde las etapas de exposición y detección para dicha segunda proteína o ARN se realizan simultáneamente o secuencialmente a las etapas de exposición y detección para dicha primera proteína o ARN.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el ADN que codifica dicho primer o segundo ARN o dicha primera o segunda proteínas está conectado operativamente a

(a) un promotor condicional; o

(b) un promotor inducible con una aplicación de un inductor antes de la exposición de las células a la primera o segunda baliza molecular.

11. El método de la reivindicación 1 o 7, en donde la secuencia de ADN que codifica dicha primera o segunda etiqueta epitópica está fuera del marco con una porción de la secuencia de ADN que codifica la primera o segunda proteína, respectivamente.

12. El método de la reivindicación 1 o 7, en donde la secuencia de ADN que codifica dicha primera o segunda etiqueta epitópica está en marco con una porción de la secuencia de ADN que codifica la primera o segunda proteína, respectivamente.

13. El método de la reivindicación 1, en donde la primera proteína o ARN es una proteína o un ARN preseleccionado, y donde dicho primer constructo de ADN que codifica la proteína o el ARN preseleccionados codifica adicionalmente un primer marcador de resistencia a fármacos; en donde el método comprende adicionalmente las etapas de:

(d) seleccionar las células resistentes a un fármaco al que dicho primer marcador de resistencia a fármacos confiere resistencia;

(e) aislar las células detectadas que emiten fluorescencia; y

(f) generar una línea celular que expresa la proteína o ARN preseleccionados haciendo crecer las células aisladas.

14. El método de la reivindicación 13, en donde dicho aislamiento de las células detectadas que emiten fluorescencia se lleva a cabo utilizando la tecnología de clasificación celular activada por fluorescencia.

15. El método de la reivindicación 13 o 14, en donde la secuencia de ADN que codifica la primera etiqueta epitópica está en marco con la porción del constructo de ADN que codifica la primera proteína.

16. El método de la reivindicación 13 o 14, en donde la secuencia de ADN que codifica la primera etiqueta epitópica está fuera de marco con la porción del constructo de ADN que codifica la primera proteína.

17. El método de la reivindicación 13, en donde dicha línea celular expresa una segunda proteína preseleccionada o un segundo ARN preseleccionado; comprendiendo dichas etapas adicionalmente introducir en la línea celular un segundo constructo de ADN que codifica dicha segunda proteína preseleccionada o segundo ARN preseleccionado y un segundo marcador de resistencia a fármacos, seleccionar las células resistentes a un fármaco al que dicho segundo marcador de resistencia a fármacos confiere resistencia, exponer dichas células a una segunda baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con el segundo ARN preseleccionado o un transcrito de ARNm que codifica dicha segunda proteína preseleccionada, y aislar las células que muestran fluorescencia de cada una de dichas primera y segunda balizas moleculares.

18. El método de la reivindicación 17, en donde dicho segundo transcrito de ARN o ARNm que codifica dicha segunda proteína está asociado con una segunda etiqueta epitópica que proporciona una secuencia de ácido nucleico diana única para el reconocimiento por una baliza molecular, donde dicha segunda baliza molecular emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN de la segunda etiqueta epitópica.

19. El método de la reivindicación 18, en donde la secuencia de ADN que codifica dicha segunda etiqueta epitópica está en marco con la porción del constructo de ADN que codifica dicha segunda proteína.

20. El método de la reivindicación 18, en donde la secuencia de ADN que codifica dicha segunda etiqueta epitópica está fuera del marco con la porción del constructo de ADN que codifica dicha segunda proteína.

21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en donde las etapas de introducción, selección, exposición y aislamiento para dicha segunda proteína o ARN preseleccionados se realizan simultáneamente o secuencialmente con la introducción, selección, exposición, y aislamiento para dicha primera proteína o ARN preseleccionados.

22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21, en donde el ADN que codifica dicha primera o segunda proteína o ARN preseleccionados está conectado operativamente a

(a) un promotor condicional; o

(b) un promotor inducible con la aplicación de un inductor antes de la exposición de las células a la primera

o segunda baliza molecular.

23. El método de la reivindicación 13, en donde dicha proteína o ARN preseleccionados están sobreexpresados, que comprende adicionalmente las etapas de:

g) introducir en las células un segundo constructo de ADN que codifica la primera proteína o ARN preseleccionados y un segundo marcador de resistencia a fármacos, y donde dicho transcrito de ARN o ARNm que codifica dicha primera proteína está asociado con al menos una segunda etiqueta epitópica que proporciona una única secuencia de ácido nucleico diana para el reconocimiento por una baliza molecular;

(h) seleccionar las células resistentes a un fármaco al cual confiere resistencia dicho segundo marcador de resistencia a fármacos;

(i) exponer las células a una segunda baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN de la segunda etiqueta epitópica; y

(j) aislar las células que muestran fluorescencia de cada una de la primera y segunda balizas moleculares.

24. El método de la reivindicación 23, en donde la segunda etiqueta epitópica es la misma o diferente de la primera etiqueta epitópica.

25. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 24, en donde la molécula de ARN se selecciona del grupo que consiste en ARN antisentido, ARNm, ARNr, ARNhn y ARNsn.

26. El método de la reivindicación 23, en donde las etapas de introducción para dicho primer constructo de ADN y dicho segundo constructo de ADN se realizan secuencialmente.

27. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en donde el ADN que codifica dicha primera o segunda proteína o ARN está conectado operativamente a

(a) un promotor condicional; o

(b) un promotor inducible con la aplicación de un inductor antes de exponer las células a la primera o segunda baliza molecular.

28. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente las etapas de:

(d) cuantificar el nivel de fluorescencia de dicha primera baliza molecular en dichas células; y

(e) correlacionar dicho nivel de fluorescencia de dicha primera baliza molecular con el nivel de expresión de dicho primer transcrito de ARN o ARNm que codifica dicha primera proteína.

29. El método de la reivindicación 6, que comprende adicionalmente las etapas de cuantificar el nivel de fluorescencia de dicha segunda baliza molecular en dichas células, y correlacionar dicho nivel de fluorescencia de dicha segunda baliza molecular con el nivel de expresión de dicho segundo transcrito de ARN o ARNm que codifica dicha segunda proteína.

30. El método de la reivindicación 29, en donde dicho segundo transcrito de ARN o ARNm que codifica dicha segunda proteína está asociado con una segunda etiqueta epitópica que proporciona una única secuencia de ácido nucleico diana para el reconocimiento por una baliza molecular, en donde dicha segunda baliza molecular emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN de la segunda etiqueta epitópica.

31. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, en donde dichos primer y segundo ARN se seleccionan del grupo que consiste en un ARN que codifica una proteína, un ARN estructural, y un ARN antisentido.

32. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, en donde dichas células están fijadas.

33. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32, en donde dicha fluorescencia se cuantifica mediante microscopía de fluorescencia o tecnología de clasificación de células activada por fluorescencia.

34. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33, en donde dichas células que expresan el primer o segundo transcrito de ARN o ARNm que codifican la primera o segunda proteínas se aíslan utilizando la tecnología de clasificación celular activada por fluorescencia.

35. El método de la reivindicación 11, que comprende adicionalmente aislar las células detectadas.