Líneas celulares que expresan Nav y métodos para su utilización.

Una línea celular manipulada genéticamente para expresar de manera estable un NaV 1.

7 humano que comprende una subunidad alfa 9 de NaV, una subunidad beta 1 de NaV y una subunidad beta 2 de NaV, en la que la línea celular se produce mediante un método que comprende las etapas de:

a) proporcionar una pluralidad de células que expresan mRNA que codifica o codifican el NaV 1.7 humano;

b) dispersar las células individualmente en recipientes de cultivo individuales, proporcionando de este modo una pluralidad de cultivos celulares separados;

c) cultivar las células con un conjunto de condiciones de cultivo deseadas usando un método de cultivo celular automatizado caracterizado porque las condiciones son sustancialmente idénticas para cada uno de los cultivos celulares separados, durante el cual se normaliza el cultivo de las diversas células por cultivo celular separado, y en el que se hacen pases de los cultivos separados en el mismo calendario;

d) someter a ensayo los cultivos de células separados para medir la expresión del NaV 1.7 humano al menos dos veces y para medir un factor Z' en el ensayo de potencial de membrana; e

e) identificar un cultivo celular separado que expresa el NaV 1.7 humano a un nivel uniforme en ambos ensayos y que produce un factor Z' de al menos 0,6 en el ensayo de potencial de membrana, obteniendo de este modo dicha colección de células;

en la que el ensayo de potencial de membrana comprende:

i) cultivar en placas células de la línea celular a 10.000 - 25.000 células por pocillo en una placa de 384 pocillos en medio de crecimiento;

ii) mantener las células en la placa de 384 pocillos en una incubadora de cultivo celular a 37 ºC con CO2 al 5% durante 22-24 horas;

iii) retirar el medio de crecimiento de la placa de 384 pocillos;

iv) incubar las células en la placa de 384 pocillos con un colorante de potencial de membrana de florescencia azul diluido en un tampón de carga que comprende NaCl 137 mM, KCl 5 mM, CaCl2 1,25 mM, HEPES 25 mM, glucosa 10 mM durante 1 hora a 37 ºC;

v) añadir a las células incubadas a) 25 μM de veratridina y 5-25 μg/ml de veneno de escorpión para pocillos de control positivo; o b) un tampón de control para pocillos de control negativo;

vi) cargar la placa de 384 pocillos en un lector de placas fluorescentes de alto rendimiento; y

vii) medir las señales de fluorescencia de células de los pocillos de control positivo y los pocillos de control negativo, en la que el factor Z' se calcula usando las señales de fluorescencia de células medidas de la etapa vii) y usando la ecuación:

Factor Z' ≥ 1 - ((3σcontrol positivo + 3σcontrol negativo)/ (μcontrol positivo - μcontrol negativo))

en la que control σpositivo representa una desviación típica de los controles positivos del ensayo; control σnegativo representa una desviación típica de los controles negativos del ensayo; control μpositivo representa el valor medio de los controles positivos; y control μnegativo representa el valor medio de los controles negativos.