Un método para aislar una pluralidad de células, en el que al menos un subconjunto de las células expresa un ARN que no es expresado por otro subconjunto de las células,

que comprende las etapas de:

introducir en las células una pluralidad de ADN que codifican una pluralidad de ARN diferentes, en el que cada ADN codifica además una secuencia etiqueta de ácido nucleico, y en el que al menos un subconjunto de la pluralidad de los ADN codifica la misma secuencia etiqueta de ácido nucleico;

exponer dichas células a una misma sonda de señalización que produce una señal detectable después de hibridar con dicha misma secuencia etiqueta de ácido nucleico; y aislar dichas células que producen la señal.

Métodos y materiales que usan sondas de señalización

Antecedentes de la Invención

Las sondas de ácido nucleico que reconocen e informan de la presencia de una secuencia específica de ácido nucleico se han usado para detectar ácidos nucleicos específicos principalmente en reacciones in vitro. Véase, por ejemplo, Patente U.S. 5.925.517. Un tipo de sonda se diseña para tener una estructura en forma de horquilla, con una cadena central de nucleótidos complementaria a la secuencia diana y extremos que comprenden secuencias cortas mutuamente complementarias. Véase, por ejemplo, Tyagi y Kramer, Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996) .

Un extremo de la sonda en forma de tallo-bucle se une covalentemente a un fluoróforo y el otro a un resto apantallador. Cuando están en su estado nativo con los extremos hibridados, la proximidad del fluoróforo y el apantallador es tal que se produce una fluorescencia relativamente baja o esencialmente no se produce fluorescencia. La sonda tallo-bucle experimenta un cambio conformacional cuando hibrida son su ácido nucleico diana que resulta en el cambio detectable en la producción de fluorescencia por el fluoróforo. Los investigadores han usado la sonda en forma de horquilla para realizar la visualización in situ de ARN mensajero (Matsuo, 1998, Biochim. Biophys. Acta 1379: 178-184) en células vivas. La Patente U.S. 6.692.965 se refiere al uso de balizas moleculares que reconocen un ARNm diana. Dichas balizas pueden usarse conjuntamente con FACS para separar células.

Resumen de la Invención

La presente invención describe métodos y composiciones que comprenden sondas nuevas de señalización para analizar o aislar células o generar líneas celulares que expresan uno o más ARN. El método se basa en la detección de la señal producida por las sondas después de su hibridación con la secuencia diana. El ARN puede introducirse en las células mediante una construcción de ADN, o puede sospecharse que las células expresan el ARN endógenamente. La construcción de ADN puede codificar además una secuencia etiqueta y la sonda de señalización es complementaria a la secuencia etiqueta. En una realización, las células aisladas o las líneas celulares generadas son funcionalmente nulas para la expresión o tienen una expresión reducida de una o más proteínas o ARN preseleccionados. La invención también describe un método para generar animales transgénicos usando células que se aíslan según los métodos descritos.

La invención describe sondas de señalización usadas en un método para cuantificar el nivel de expresión de uno o más transcritos de ARN. Además, las sondas de señalización pueden usarse en un método para identificar un compuesto o secuencia de ARN que modula la transcripción de al menos un ARN preseleccionado. En otra realización, las sondas de señalización pueden usarse en un método para identificar eventos de recombinación genética en células vivas. La sonda de señalización comprende una o más cadenas de nucleótidos, en el que la sonda de señalización comprende nucleótidos que son complementarios a un ácido nucleico diana (por ejemplo, ARN) de interés y en el que la sonda de señalización comprende además una pareja de interacción que comprende dos restos. La estructura de la sonda de señalización es tal que cuando la sonda de señalización no está hibridada con la secuencia diana, los dos restos de la pareja de interacción están físicamente localizados de manera tal que no se produce señal o se produce señal de fondo. Cuando la sonda de señalización hibrida con la secuencia diana, los dos restos están de tal manera que se produce una señal. Alternativamente, los restos de la sonda de señalización pueden ser tales que cuando la sonda no está hibridada con la diana, se produce una señal particular y se produce una señal diferente después de la hibridación de la sonda con la secuencia diana. Los dos restos de la pareja de interacción pueden estar unidos a uno o más extremos de una o más cadenas de la sonda de señalización. Alternativamente, los restos pueden estar incorporados internamente en una o más cadenas de la sonda de señalización. Los nucleótidos de la sonda de señalización también pueden estar modificados.

La presente invención también describe sondas proteasa. En una realización, la sonda de señalización o proteasa comprende dos cadenas separadas de ácido nucleico o ácido nucleico modificado, una o más partes de las cuales hibridan entre sí, y al menos un extremo de una cadena es adyacente a un extremo de la otra cadena. El ácido nucleico puede ser ADN o ARN. Para la sonda de señalización con dos cadenas separadas, en una realización, una cadena tiene al menos un resto apantallador en un extremo y la otra cadena tiene al menos un fluoróforo en el extremo adyacente. Para la sonda proteasa, en una realización, una cadena tiene al menos una enzima proteolítica en un extremo y la otra cadena tiene al menos un inhibidor de la enzima proteolítica en el extremo adyacente.

En otra realización, la sonda de señalización o proteasa se diseña para comprender al menos una región mutuamente complementaria y al menos una región no complementaria. En una realización, al menos una región no complementaria puede diseñarse para formar una región bucle. En una realización, la sonda se diseña para formar al menos una estructura tallo-bucle. En otra realización, la sonda forma una estructura "dumbbell" o una estructura de unión de tres brazos. En una realización, la sonda de señalización tiene al menos un fluoróforo y al menos un resto apantallador en cada extremo de la cadena. En una realización, la sonda proteasa tiene una enzima proteolítica y un inhibidor de la enzima proteolítica en cada extremo de la cadena.

En otra realización, la sonda de señalización o proteasa está químicamente modificada. Uno o más de los núcleos de tipo azúcar-fosfodiéster, 2'OH y base purina o pirimidina está modificado. En una realización, el núcleo de desoxirribosa se reemplaza por ácido nucleico peptídico.

En una realización, la secuencia etiqueta es un ARN estructural, es decir, el ARN tiene estructura secundaria, preferiblemente una estructura de unión de tres brazos. En una realización, la secuencia etiqueta comprende la estructura o secuencia según la Figura 42 A, B o C. La presente invención también proporciona una construcción de ADN que comprende al menos un ADN que codifica al menos un ARN de interés y la secuencia etiqueta. La invención también describe vectores y células que comprenden la construcción de ADN.

Particularmente, la presente invención proporciona:

[1] Un método para aislar una pluralidad de células, en el que al menos un subconjunto de las células expresa un ARN que no se expresa por otro subconjunto de las células, que comprende las etapas de:

introducir en las células una pluralidad de ADN que codifican una pluralidad de ARN diferentes, en el que cada ADN codifica además una secuencia etiqueta de ácido nucleico, y en el que al menos un subconjunto de la pluralidad de los ADN codifica la misma secuencia etiqueta de ácido nucleico;

exponer dichas células a una misma sonda de señalización que produce una señal detectable después de hibridar con dicha misma secuencia etiqueta de ácido nucleico; y aislar dichas células que producen la señal.

[2] El método de [1], en el que la pluralidad de ARN diferentes forma una biblioteca de expresión.

[3] El método de [2], que comprende además crecer separadamente células aisladas individualmente para generar una pluralidad de líneas celulares separadas.

[4] El método de [2], que comprende además combinar las células aisladas.

[5] El método de [4], que comprende además crecer las células combinadas.

[6] El método de una cualquiera de [1] a [5], en el que la pluralidad de ARN diferentes, o proteínas codificadas por la pluralidad de ARN diferentes, se seleccionan del grupo que consiste en ARN o proteínas en la misma ruta biológica o relacionada, ARN o proteínas que actúan aguas arriba o abajo entre sí, ARN o proteínas que tienen una función moduladora, activadora o represora entre sí, ARN o proteínas que son dependientes entre sí para función o actividad, ARN o proteínas que son componentes del mismo complejo y proteínas de la misma familia de proteínas.

[7] El método de [1] para aislar células que expresan dos o más bibliotecas de expresión de ARN, que comprende las etapas de:... [Seguir leyendo]

1. Un método para aislar una pluralidad de células, en el que al menos un subconjunto de las células expresa un ARN que no es expresado por otro subconjunto de las células, que comprende las etapas de:

introducir en las células una pluralidad de ADN que codifican una pluralidad de ARN diferentes, en el que cada ADN codifica además una secuencia etiqueta de ácido nucleico, y en el que al menos un subconjunto de la pluralidad de los ADN codifica la misma secuencia etiqueta de ácido nucleico;

exponer dichas células a una misma sonda de señalización que produce una señal detectable después de hibridar con dicha misma secuencia etiqueta de ácido nucleico; y aislar dichas células que producen la señal.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la pluralidad de ARN diferentes forma una biblioteca de expresión.

3. El método de la reivindicación 2, que comprende además crecer separadamente células aisladas individualmente para generar una pluralidad de líneas celulares separadas.

4. El método de la reivindicación 2, que comprende además combinar las células aisladas.

5. El método de la reivindicación 4, que comprende además crecer las células combinadas.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la pluralidad de ARN diferentes, o proteínas codificadas por la pluralidad de ARN diferentes, se seleccionan del grupo que consiste en ARN o proteínas en la misma ruta biológica o relacionada, ARN o proteínas que actúan aguas arriba o abajo entre sí, ARN o proteínas que tienen una función moduladora, activadora o represora entre sí, ARN o proteínas que son dependientes entre sí para función o actividad, ARN o proteínas que son componentes del mismo complejo y proteínas de la misma familia de proteínas.

7. El método de la reivindicación 1 para aislar células que expresan dos o más bibliotecas de expresión de ARN, que comprende las etapas de:

introducir en las células una pluralidad de ADN que codifican una primera biblioteca de expresión de ARN, en el que cada ADN codifica además una primera secuencia etiqueta de ácido nucleico y en el que al menos un subconjunto de la pluralidad de ADN codifica la misma primera secuencia etiqueta de ácido nucleico;

introducir en las células una pluralidad de ADN que codifican una segunda biblioteca de expresión de ARN, en el que cada ADN codifica además una segunda secuencia etiqueta de ácido nucleico y en el que al menos un subconjunto de la pluralidad de ADN codifica la misma segunda secuencia etiqueta de ácido nucleico;

exponer las células a una primera sonda de señalización que produce una señal detectable después de hibridar con dicha primera secuencia etiqueta de ácido nucleico;

exponer las células a una segunda sonda de señalización que produce una señal detectable después de hibridar con dicha segunda secuencia etiqueta de ácido nucleico; y aislar las células que producen ambas señales.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la secuencia etiqueta de ácido nucleico comprende múltiples secuencias diana, en el que una sonda de señalización hibrida con cada secuencia diana.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el ADN codifica múltiples secuencia etiqueta de ácido nucleico.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el ADN que codifica dicha secuencia etiqueta de ácido nucleico está

(a) en marco con el ADN que codifica dicho ARN; o

(b) fuera de marco con el ADN que codifica dicho ARN.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho ADN codifica un ARN antisentido, un ARNsh o un ARNsi.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el ADN codifica además un marcador de selección y en el que el método comprende además la etapa de seleccionar las células usando el marcador de selección después de introducir el ADN en las células pero antes de exponer dichas células a la sonda de señalización.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho ADN está unido de manera operativa a un promotor condicional.

14. El método de la reivindicación 13, en el que el ARN codificado por el ADN, o la proteína codificada por el ARN, es letal o perjudicial para la célula cuando se expresa.

15. El método de la reivindicación 13 ó 14 que comprende además la etapa de añadir a las células un compuesto que modula la expresión de dicho ARN o pluralidad de ARN antes de la etapa de exposición.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4 a 15 que comprende además la etapa de

(a) cultivar las células aisladas; o

(b) generar una pluralidad de líneas celulares por cultivo de las células aisladas.

17. El método de la reivindicación 1, en el que cada ADN de dicha pluralidad de ADN codifica además una segunda secuencia de ADN que codifica un ARN preseleccionado.

18. El método de la reivindicación 17, en el que dicha pluralidad de ADN codifica una pluralidad de ARN de ensayo variables.

19. Un método para identificar un compuesto que activa un promotor condicional, que comprende las etapas de: aislar las células por el método de la reivindicación 14 ó 15; añadir un compuesto de ensayo a dichas células aisladas; ensayar para la presencia del ARN expresado bajo el control del promotor condicional; e identificar el compuesto de ensayo como un compuesto que activa el promotor condicional si la célula expresa el ARN

bajo el control del promotor condicional.

20. Un método para identificar un ARN de ensayo que activa un promotor condicional que comprende las etapas de: aislar las células por el método de la reivindicación 14 ó 15; ensayar para la presencia del ARN bajo el control del promotor condicional; obtener las células que expresan el ARN bajo el control del promotor condicional; e identificar el ARN de ensayo que activa el promotor condicional.