MOLÉCULAS DE ANTICUERPOS CON ESPECIFICIDAD PARA IL-1 BETA HUMANA.

Un anticuerpo neutralizante con especificidad para IL-1ß humana,

que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 5 para CDR-H1, la secuencia dada en SEQ ID NO: 6 para CDR-H2 y la secuencia dada en SEQ ID NO: 7 para CDR- H3, y en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 8 para CDR- L1, la secuencia dada en SEQ ID NO: 9 para CDR-L2 y la secuencia dada en SEQ ID NO: 10 para CDR-L3

Moléculas de anticuerpos con especificidad para IL-1 beta humana.

La presente invención se refiere a una molécula de anticuerpo con especificidad para determinantes antigénicos de IL-1º. La presente invención se refiere también a los usos tera péuticos de la molécula de anticuerpo y a métodos para producir la molécula de anticuerpo.

La citoquina pro-inflamatoria interleuquina-1º (IL-1º) es un miembro de la familia de genes de IL-1 que también incluye IL-1a y el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1RA) (revisado por Dinarello, 1996, Blood, 87, 6, 2095-2147) . IL-1º está principalmente implicada en la inflamación y tiene efectos directos sobre las células endoteliales y macrofagos, asi como sobre celulas tanto T como B. Estimula las celulas del estroma de la médula ósea para producir IL-6 asi como un cierto numero de factores estimulantes de colonias y tambien induce la produccion de TNFa.

IL-1º está implicada en muchas afecciones patológicas que están asociadas con la inflamación. Éstas incluyen infecciones (virales, bacterianas, fungicas y parasiticas) , choque endotoxico, artritis, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria pelvica, esclerosis multiple, asma, osteoartritis, psoriasis, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Crohn, enfermedad de Peyronie, enfermedades del corazon (tal como aterosclerosis) , cancer de colon, enfermedad celiaca, enfermedad de la vesicula biliar, enfermedad pilonidal, peritonitis, meningoencefalitis, otras afecciones autoinmunes, pancreatitis, trauma (cirugia) , enfermedad de injerto frente a hospedante y rechazo de trasplantes.

IL-1º esta tambien implicada en el cancer, la osteoporosis y la senalizacion del dolor.

La implicación de IL-1º en la inflamacion, el dolor y otras afecciones patologicas sugiere que IL -1º es una buena diana para fármacos y otras moleculas para la profilaxis y/o el tratamiento de estas afecciones.

La forma madura de 17 kDa de IL-1º ejerce sus efectos biológicos al unirse al receptor de IL-1, IL-1R. Existen dos tipos de IL-1R: el receptor de tipo I, IL-1RI y el receptor de tipo II, IL-1RII. La unión de IL-1º a IL-1RI conduce al reclutamiento de la proteina accesoria del receptor y a la senalizacion. Por otra parte, IL-1RII ha sido denominado un receptor de "senuelo", dado que la union de IL-1º no transduce una senal. Se puede esperar que sean al menos tres tipos de anticuerpos los que se unan a IL-1º:

(i) anticuerpos que se unen a IL-1º, pero que no neutralizan la actividad biológica de IL -1RI (un anticuerpo

bloquean la unión al IL-1RI tales como los anticuerpos descritos en el documento US 2003/0026806.

Anticuerpos anti-EL-1º han sido identificados y propuestos para su uso en el tratamiento de enfermedades y afecciones mediadas por IL-1º; vease, por ejemplo, el documento WO 95/01997.

Los autores de la invención han identificado ahora un anticuerpo de IL-1º mejorado que es particularmente eficaz in vivo, por ejemplo en los modelos de inflamación in vivo descritos en esta memoria. El anticuerpo es un anticuerpo neutralizante segun se define en la alternativa (ii) anterior.

Sumario de la invencion En un primer aspecto, la presente invencion proporciona un anticuerpo neutralizante con especificidad para IL-1º humana, que comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una CDR (siglas inglesas de region determinante de la complementariedad) con la secuencia dada en SEQ ID NO:5 para CDR-H1, una CDR que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO:6 para CDR-H2 y una CDR que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO:7 para CDR-H3, y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende una CDR (region determinante de la complementariedad) que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO:8 para CDR-L1, una CDR que tiene una secuencia dada en SEQ ID NO: 9 para CDR-L2 y una CDR que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO:10 para CDR-L3.

Los residuos en los dominios variables del anticuerpo se enumeran convencionalmente de acuerdo con un sistema disenado por Kabat et al. Este sistema se recoge en Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, EE.UU. (en lo que sigue "Kabat et al. (supra) ") . Este sistema de numeracion se utiliza en la presente memoria descriptiva, excepto cuando se indique de otro modo.

Las designaciones de residuos segun Kabat no siempre se corresponden directamente con la numeracion lineal de los residuos aminoácidos. La secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que en la numeración estricta segun Kabat que corresponde a un acortamiento de o insercion en un componente estructural, ya sea marco o CDR, de la estructura de dominio variable basica. La numeracion de residuos correcta segun Kabat se puede determinar para un anticuerpo dado mediante alineación de residuos de homologia en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada segun Kabat "estandar".

Las CDRs del dominio variable de la cadena pesada estan situadas en los residuos 31-35 (CDR-H1) , residuos 50-65 (CDR-H2) y residuos 95-102 (CDR-H3) de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat. Sin embargo, de acuerdo con Chothia (Chothia, C. y Lesk, A. M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987) ) , el bucle equivalente a CDR-H1 se extiende desde el residuo 26 al residuo 32. Asi, "CDR-H1", tal como se utiliza en esta memoria, comprende los residuos 26 a 35 segun se describe por una combinacion del sistema de numeracion segun Kabat y la definicion de bucle topologico segun Chothia.

Las CDRs del dominio variable de la cadena ligera estan situadas en los residuos 24-34 (CDR-L1) , residuos 50-56 (CDR-L2) y residuos 89-97 (CDR-L3) de acuerdo con el sistema de numeracion segun Kabat. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresion "anticuerpo neutralizante" describe un anticuerpo que es capaz de neutralizar la actividad de senalizacion biologica de IL-1º, en particular bloqueando la unión de IL-1º al IL-1RI.

Incluso mas preferiblemente, el anticuerpo del primer aspecto de la presente invencion comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEQ ID NO:3.

Incluso mas preferiblemente, el anticuerpo del primer aspecto de la presente invencion comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEQ ID NO:4.

El anticuerpo de la presente invencion comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEQ ID NO:5 para CDR-H1, la secuencia dada en SEQ ID NO:6 para CDR-H2 y la secuencia dada en SEQ ID NO:7 para CDR-H3, y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEQ ID NO:8 para CDR-L1, la secuencia dada en SEQ ID NO:9 para CDR-L2 y la secuencia dada en SEQ ID NO:10 para CDR-L3

En una realizacion mas preferida de la invencion, el anticuerpo comprende una cadena pesada en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 3 y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto de la presente invencion, se proporciona un anticuerpo de acuerdo con cualquiera del primer aspecto de la invencion, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 3 y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 4.

En una realizacion alternativamente preferida, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal murino, en donde el anticuerpo monoclonal comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 3, y en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 4. A este anticuerpo monoclonal murino se le alude en esta memoria como "IC8"... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo neutralizante con especificidad para IL-1º humana, que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 5 para CDR-H1, la secuencia dada en SEQ ID NO: 6 para CDR-H2 y la secuencia dada en SEQ ID NO: 7 para CDR-H3, y en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 8 para CDR-L1, la secuencia dada en SEQ ID NO: 9 para CDR-L2 y la secuencia dada en SEQ ID NO: 10 para CDR-L3.

2. Un anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho anticuerpo neutralizante es una molecula de anticuerpo injertada a CDR.

3. La molécula de anticuerpo de la reivindicacion 2, en donde el dominio variable comprende regiones marco del aceptor humano y CDRs de donantes no humanas.

4. Un anticuerpo injertado a CDR de acuerdo con la reivindicacion 2 o la reivindicacion 3, en donde la cadena pesada comprende la secuencia gH3 dada en SEQ ID NO: 15.

5. Un anticuerpo injertado a CDR de acuerdo con la reivindicacion 2 o la reivindicacion 3, en donde la cadena ligera comprende la secuencia gL3 dada en SEQ ID NO: 20.

6. Un anticuerpo injertado a CDR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde la cadena pesada comprende la secuencia gH3 dada en SEQ ID NO: 15 y la cadena ligera comprende la secuencia gL3 dada en SEQ ID NO: 20.

7. Un anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 1, que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 3 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 4.

8. Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo completa con cadenas pesada y ligera de longitud completa.

9. Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la molécula de anticuerpo es un fragmento Fab, Fab', F (ab') 2, Fv o scFv.

10. Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 9, que tiene en el extremo C-terminal de su cadena pesada, una region de bisagra modificada que contiene uno o dos residuos cisteina a los que se puede fijar una molécula de efector o de informador.

11. Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 10, que tiene una molecula de efector o una molécula de informador fijada a la misma.

12. Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 11, en donde la molecula de efector comprende uno o mas polimeros.

13. Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 12, en donde el uno o mas polimeros es/son un polimero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituido, o un polisacarido ramificado o no ramificado.

14. Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde el uno o mas polimeros es/son un metoxipoli (etilenglicol) o poli (etilenglicol) .

15. Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 11, que tiene fijada a uno de los residuos cisteina en el extremo C-terminal de la cadena pesada un grupo lisil-maleimida o lisil-bis-maleimida, en donde cada uno de los grupos amino del residuo lisilo tiene enlazado covalentemente al mismo un residuo metoxipoli (etilenglicol) con un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da.

16. Una molécula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 1, que es un fragmento Fab modificado que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 20 y que tiene en el extremo C-terminal de su cadena pesada una region de bisagra modificada que contiene un residuo cisteina al que puede fijarse una molecula de efector o de informador.

17. Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 1, que es un fragmento Fab modificado que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 20 y que tiene en el extremo C-terminal de su cadena pesada una región de bisagra modificada que contiene un residuo cisteina al que puede fijarse una molecula de efector o de informador.

18. Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 17, en donde su cadena pesada comprende o consiste en los residuos de aminoacidos numeros 22 a 251 de la secuencia dada en SEQ ID NO: 71, y en donde su cadena ligera comprende o consiste en los residuos de aminoacidos numeros 22 a 235 de la secuencia dada en SEQ ID NO. 70.

19. Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 17 o la reivindicacion 18, que tiene fijado al residuo cisteina en el extremo C-terminal de la cadena pesada un grupo lisil-maleimida, en donde cada uno de los grupos amino del residuo lisilo tiene enlazado de forma covalente al mismo un residuo metoxipoli (etilenglicol) con un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da.

20. Una secuencia de ADN aislada que codifica la o las cadenas pesada y/o ligera de una molecula de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.

21. Un vector de clonacion o expresion que comprende una o mas secuencias de ADN de acuerdo con la reivindicacion 20.

22. El vector de acuerdo con la reivindicacion 21, en donde el vector comprende la secuencia dada en SEQ ID NO:

69.

23. Una celula hospedante que comprende uno o mas vectores de clonacion o expresion de acuerdo con las reivindicaciones 21 ó 22.

24. Un procedimiento para la producción de la molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que comprende cultivar la celula hospedante de la reivindicacion 23 y aislar la molecula de anticuerpo.

25. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en combinacion con uno o mas de un excipiente, diluyente o soporte farmaceuticamente aceptable.

26. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende adicionalmente otros ingredientes activos.