FRAGMENTOS DE ANTICUERPO MODIFICADOS.

Fragmento de anticuerpo de IgG al que se une una o más moléculas efectoras seleccionadas de un polímero con un peso molecular promedio en el intervalo de 500 Da a 100.

000 Da caracterizado porque está ausente el enlace disulfuro entre cadenas nativas entre las regiones constantes de la cadena pesada (CH1) y ligera (CL) y las regiones constantes de la cadena pesada (CH1) y la cadena ligera (CL) están unidas mediante un enlace disulfuro entre cadenas entre un par de cisteínas, modificadas por ingeniería, una en la región constante de la cadena ligera (CL) y la otra en la región constante de la cadena pesada (CH1), en el que el último enlace disulfuro está ampliamente inaccesible para agentes reductores y moléculas efectoras, de tal manera que permanece intacto durante la unión a molécula efectora y en el que la posición del par de cisteínas, modificadas por ingeniería, se selecciona de la posición 116 de la cadena ligera y 138 de la cadena pesada, la posición 119 de la cadena ligera y 128 de la cadena pesada o la posición 210 de la cadena ligera y 129 de la cadena pesada (numeración de Kabat)

Fragmentos de anticuerpo modificados La presente invención se refiere a fragmentos de anticuerpo y más específicamente proporciona fragmentos de anticuerpo a los que se unen una o más moléculas efectoras y métodos para su producción.

La alta especificidad y afinidad de regiones variables de anticuerpos hace que sean agentes terapéuticos y de diagnóstico ideales, particularmente para modular interacciones proteína:proteína. Los fragmentos de anticuerpo están demostrando ser agentes terapéuticos versátiles, tal como se observa mediante el reciente éxito de productos tales como ReoPro®. La función de direccionamiento codificada en Fv, Fab, Fab', F (ab) 2 y otros fragmentos de anticuerpo puede usarse directamente o puede conjugarse con una o más moléculas efectoras tales como fármacos citotóxicos, toxinas o moléculas poliméricas para aumentar la eficacia. Por ejemplo, dado que estos fragmentos carecen de una región Fc tienen una semivida en circulación corta en animales pero esto puede mejorarse mediante conjugación con determinados tipos de polímero tales como polietilenglicol (PEG) . Se ha mostrado que aumentar el tamaño del PEG conjugado aumenta la semivida en circulación desde minutos hasta muchas horas y se ha demostrado la modificación de un Fab' con PEG que oscila desde 5 kDa hasta 100 kDa (Chapman et al., 1999, Nature Biotechnology, 17, 780-783; Leong et al., 2001, Cytokine, 16, 106-119; Chapman, 2002, Advanced Drug Deliver y Reviews, 54, 531-545) . Actualmente fragmentos de anticuerpo pegilados tales como CDP870 están sometiéndose a ensayos clínicos en los que el efecto del PEG conjugado es llevar la semivida en circulación hasta niveles aceptables para la terapia.

Pueden unirse moléculas efectoras a fragmentos de anticuerpo mediante varios métodos diferentes, incluyendo mediante azúcares de aldehído o más comúnmente mediante cualquier grupo funcional de aminoácido terminal o de cadena lateral de aminoácido disponible ubicado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. El sitio de unión de moléculas efectoras puede ser o bien al azar o bien específico del sitio.

La unión al azar se logra con frecuencia mediante aminoácidos tales como lisina y esto da como resultado que se unen moléculas efectoras en varios sitios a lo largo de todo el fragmento de anticuerpo dependiendo de la posición de las lisinas. Aunque esto ha sido satisfactorio en algunos casos, no puede controlarse la ubicación exacta y el número de moléculas efectoras unidas y esto puede conducir a pérdida de actividad por ejemplo si se unen demasiado pocas y/o pérdida de afinidad si por ejemplo interfieren con el sitio de unión a antígeno (Chapman 2002 Advanced Drug Deliver y Reviews, 54, 531-545) . Como resultado, la unión específica del sitio controlada de moléculas efectoras es habitualmente el método de elección.

La unión específica del sitio de moléculas efectoras se logra lo más comúnmente mediante la unión a residuos de cisteína ya que tales residuos son relativamente poco frecuentes en fragmentos de anticuerpo. Las regiones bisagra de anticuerpo son regiones populares para la unión específica del sitio ya que contienen residuos de cisteína y están alejadas de otras regiones del anticuerpo que probablemente participan en la unión a antígeno. Las regiones bisagra adecuadas o bien se producen de manera natural en el fragmento o bien pueden crearse usando técnicas de ADN recombinante (véase por ejemplo el documento US 5.677.425; el documento WO98/25971; Leong et al., 2001 Cytokine, 16, 106-119; Chapman et al., 1999 Nature Biotechnology, 17, 780-783) . Alternativamente, o además, también pueden diseñarse mediante ingeniería cisteínas específicas del sitio en el fragmento de anticuerpo por ejemplo para crear cisteína (s) expuesta (s) en la superficie para la unión de molécula efectora (documento US 5.219.996) .

Recientemente se han descrito ejemplos de fragmentos de anticuerpo en los que se usan cisteínas nativas y modificadas por ingeniería para la unión específica del sitio de moléculas efectoras (véanse los documentos W02005003169, W02005003170 y W02005003171) . En todos estos fragmentos está ausente el enlace disulfuro entre cadenas nativas entre las regiones constantes de la cadena pesada y ligera (CH1 y CL) o bien porque las cisteínas entre cadenas se han usado como sitio de unión para moléculas efectoras o bien porque las cisteínas entre cadenas se han sustituido por otro aminoácido para evitar la unión de molécula efectora a esas cisteínas. Estos fragmentos también pueden comprender cisteínas, modificadas por ingeniería, para su uso como sitios de unión de molécula efectora. En un ejemplo estas cisteínas, modificadas por ingeniería, son un par de cisteínas, modificadas por ingeniería, que forman un enlace disulfuro entre las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del material de partida de fragmento de anticuerpo; sin embargo dicho enlace disulfuro se pierde una vez que las moléculas efectoras se unen a esas cisteínas. El documento WO 03/080674 trata de una cisteína, modificada por ingeniería.

La presente invención proporciona conjugados alternativos de fragmento de anticuerpo-molécula efectora en los que las cadenas pesada y ligera de los fragmentos de anticuerpo están unidas mediante un enlace disulfuro entre cadenas, modificado por ingeniería, que no es el enlace disulfuro entre cadenas nativas. Este enlace disulfuro entre cadenas, modificado por ingeniería, se retiene durante la unión de molécula efectora incluso cuando se usan fuertes agentes reductores. La invención también proporciona sitios en la superficie de contacto cadena ligera:cadena pesada del anticuerpo en la que pueden diseñarse mediante ingeniería satisfactoriamente pares de cisteínas para introducir un enlace disulfuro que está lo suficientemente incrustado como para ser ampliamente inaccesible para agentes reductores y moléculas efectoras.

Una ventaja particular de estos fragmentos se encuentra en que el enlace disulfuro entre las cisteínas entre cadenas modificadas por ingeniería permanecen intactas durante la unión de molécula efectora.

Por tanto, según la presente invención se proporciona un fragmento de anticuerpo al que se une una o más moléculas efectoras caracterizado porque está ausente el enlace disulfuro entre cadenas nativas entre las regiones constantes de la cadena pesada (CH1) y ligera (CL) y las regiones constantes de la cadena pesada (CH1) y la cadena ligera (CL) están unidas mediante un enlace disulfuro entre cadenas entre un par de cisteínas modificadas por ingeniería , una en la región constante de la cadena ligera (CL) y la otra en la región constante de la cadena pesada (CH1) .

La expresión “enlace disulfuro entre cadenas nativas” tal como se usa en el presente documento se refiere al enlace disulfuro entre cadenas que existe entre la cisteína en las regiones constantes de la cadena pesada y ligera codificada en un gen de anticuerpo de línea germinal que se produce de manera natural. En particular las cisteínas entre cadenas nativas son una cisteína en la región constante de la cadena ligera (CL) y una cisteína en la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que están unidas mediante enlace disulfuro entre sí en anticuerpos que se producen de manera natural. Pueden encontrarse normalmente ejemplos de tales cisteínas en la posición 214 de la cadena ligera y 233 de la cadena pesada de IgG1 humana, 127 de la cadena pesada de IgM, IgE, IgG2, IgG3, IgG4 humanas y 128 de la cadena pesada de IgD e IgA2B humanas, tal como se define por Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, EE.UU. Se apreciará que las posiciones exactas de estas cisteínas pueden variar de la de los anticuerpos que se producen de manera natural si se ha realizado cualquier modificación, tal como deleción, inserción y/o sustitución al fragmento de anticuerpo.

En los fragmentos de anticuerpo de la presente invención está ausente el enlace disulfuro entre cadenas nativas. El enlace disulfuro entre cadenas nativas puede estar ausente porque una o más moléculas efectoras se unen a las cisteínas entre cadenas, véanse por ejemplo los fragmentos descritos en los documentos W02005003170 y W02005003171. Por tanto, en una realización de la invención está ausente el enlace disulfuro entre cadenas nativas porque una molécula efectora está unida a la cisteína entre cadenas nativas de CL y la cisteína entre cadenas nativas de CH1 en el fragmento de anticuerpo. En una... [Seguir leyendo]

1. Fragmento de anticuerpo de IgG al que se une una o más moléculas efectoras seleccionadas de un polímero con un peso molecular promedio en el intervalo de 500 Da a 100.000 Da caracterizado porque está ausente el enlace disulfuro entre cadenas nativas entre las regiones constantes de la cadena pesada (CH1) y ligera (CL) y las regiones constantes de la cadena pesada (CH1) y la cadena ligera (CL) están unidas mediante un enlace disulfuro entre cadenas entre un par de cisteínas, modificadas por ingeniería, una en la región constante de la cadena ligera (CL) y la otra en la región constante de la cadena pesada (CH1) , en el que el último enlace disulfuro está ampliamente inaccesible para agentes reductores y moléculas efectoras, de tal manera que permanece intacto durante la unión a molécula efectora y en el que la posición del par de cisteínas, modificadas por ingeniería, se selecciona de la posición 116 de la cadena ligera y 138 de la cadena pesada, la posición 119 de la cadena ligera y 128 de la cadena pesada o la posición 210 de la cadena ligera y 129 de la cadena pesada (numeración de Kabat) .

2. Fragmento de anticuerpo según la reivindicación 1, en el que al menos una molécula efectora se une a una cisteína en el fragmento de anticuerpo.

3. Fragmento de anticuerpo en el que las regiones constantes de la cadena pesada (CH1) y la cadena ligera

(CL) están unidas mediante un enlace disulfuro entre cadenas entre un par de cisteínas, modificadas por ingeniería, caracterizado porque la posición del par de cisteínas se selecciona de la posición 116 de la cadena ligera y 138 de la cadena pesada, la posición 119 de la cadena ligera y 128 de la cadena pesada o la posición 210 de la cadena ligera y 129 de la cadena pesada (numeración de Kabat) .

4. Fragmento de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el fragmento de anticuerpo es Fab o Fab'.

5. Fragmento de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que las cisteínas entre cadenas nativas se han sustituido por otro aminoácido.

6. Fragmento de anticuerpo según la reivindicación 5, en el que las cisteínas entre cadenas nativas se han sustituido por serina.

7. Fragmento de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el fragmento de anticuerpo es Fab' y una molécula efectora se une a una cisteína en la región bisagra.

8. Fragmento de anticuerpo según la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que la molécula efectora es PEG.

9. Método de producción de un fragmento de anticuerpo según la reivindicación 1 que comprende:

a) tratar un fragmento de anticuerpo en el que las regiones constantes de la cadena pesada (CH1) y la cadena ligera (CL) están unidas mediante un enlace disulfuro entre cadenas entre un par de cisteínas, modificadas por ingeniería, una en la región constante de la cadena ligera (CL) y la otra en la región constante de la cadena pesada (CH1) con un agente reductor que puede generar un grupo tiol libre en una cisteína del fragmento de anticuerpo en el que la posición del par de cisteínas, modificadas por ingeniería, se selecciona de la posición 116 de la cadena ligera y 138 de la cadena pesada, la posición 119 de la cadena ligera y 128 de la cadena pesada o la posición 210 de la cadena ligera y 129 de la cadena pesada,

b) hacer reaccionar el fragmento tratado con una molécula efectora.

10. Método según la reivindicación 9, que comprende además una etapa (c) en la que se purifica el fragmento de anticuerpo según la reivindicación 1.

11. Método según la reivindicación 9 o reivindicación 10, en el que el agente reductor es un agente reductor distinto de tiol.