Un método para optimizar sondas de oligonucleótidos para uso en un ensayo de hibridación,

donde dicho métodocomprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una pluralidad de sondas de oligonucleótidos en una matriz de hibridación;

b) proporcionar diluciones seriadas de una muestra genómica, en donde la muestra genómica está marcada;

c) hibridar la muestra genómica marcada y diluida en serie con las sondas en la matriz, de tal manera que seproduce una intensidad de señal para cada una de las sondas, en donde la etapa de hibridación se lleva a cabo unavez por lo menos;

d) generar computacionalmente los datos de la regresión ponderada a partir de la intensidad de la señal producidapor cada una de las sondas; e

e) identificar las sondas optimizadas a partir de una pluralidad de sondas de oligonucleótidos en una matriz dehibridación para uso en el ensayo utilizando un algoritmo de selección de sondas; donde las sondas que muestranintensidades que corresponden a las diluciones seriadas de la muestra genómica, son reproducibles, y estánfuertemente relacionadas con sondas no optimizadas.

Método de selección de sondas optimizadas.

Antecedentes de la invención

La llegada de la tecnología de micromatrices de ADN hace posible la construcción de una matriz de cientos de miles de secuencias de ADN en un área muy pequeña, del tamaño de un portaobjetos de microscopio.

Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 6.375.903 y la patente de EE.UU N° 5.143.854. La descripción de la patente de EE.UU. Nº 6.375.903, permite la construcción del llamado sintetizador de matrices sin máscara (MAS) instrumental en el que se utiliza la luz para dirigir la síntesis de las secuencias de ADN, la dirección de la luz que se controla utilizando un dispositivo digital (DMD) .Utilizando un instrumental MAS, la selección de secuencias de ADN que se van a construir en la micromatriz está bajo el control del software de manera que se pueden construir por encargo matrices personalizadas individualmente. En general, la tecnología de síntesis de micromatrices de ADN basada en MAS permite la síntesis en paralelo de más de 786.000 oligonucleótidos únicos en un área muy pequeña de un portaobjetos de microscopio estándar. Las micromatrices se sintetizan generalmente mediante el uso de luz para dirigir que oligonucleótidos se sintetizan en lugares específicos en una matriz, estos lugares se denominan posiciones. Típicamente, se sintetiza una secuencia de nucleótidos en cada posición de la matriz, es decir, hay múltiples sondas en cada posición, pero todas estas sondas tienen la misma secuencia de nucleótidos. Para determinadas aplicaciones, pueden estar presentes oligonucleótidos de secuencias diferentes dentro de una posición de la matriz, y se pueden controlar la proporción y la dirección (5'-3 ', o 3'-5') de estos oligonucleótidos.

Con la disponibilidad de la totalidad del genoma de cientos de organismos, para los que generalmente se ha depositado una secuencia de referencia en una base de datos pública, las micromatrices se han utilizado para realizar análisis de secuencia del ADN aislado de tales organismos. Los métodos de micromatrices que por ejemplo, permiten cuantificar los cambios en el número de copias de ADN son útiles para la determinación de las aberraciones cromosómicas en eucariotas superiores que a menudo están vinculadas a estados de enfermedad. Los cambios en el número de copias suelen ser el resultado de amplificación o deleciones de fragmentos de los cromosomas. Si bien se pueden detectar fácilmente amplificaciones y deleciones o translocaciones grandes por métodos tradicionales de cariotipado, la amplificación o la supresión de fragmentos de ADN más pequeños dentro de un cromosoma puede ser difícil o imposible de detectar por estos métodos. En consecuencia, resulta cada vez más importante para el análisis genético utilizar las sondas de oligonucleótidos más precisas.

Recientemente, varios grupos de investigación han desarrollado métodos para optimizar las sondas. Por ejemplo, para evitar la hibridación cruzada de secuencias muy similares en una micromatriz, los investigadores han desarrollado un método para determinar el número y la longitud óptima de las sondas específicas de genes para estudios de perfiles de transcripción de precisión. El estudio examinó longitudes de sondas de 25 a 1000 nt. Se encontró que las sondas largas producían una intensidad de señal mejor que las sondas cortas. Sin embargo, la intensidad de la señal de las sondas cortas se podría mejorar añadiendo espaciadores o utilizando una mayor concentración de sonda para localización. (Véase Chou et al., Optimization of probe length and the number of probes per gene for optimal microarray analysis of gene expression. Nucleic Acids Res.2004 Jul 08; 32 (12) : e99) . Se cree que el uso de métodos alternativos de optimización de sondas en la identificación de modificaciones genéticas sería una contribución deseable a la técnica.

La patente de EE.UU 2002/13301 está relacionada con métodos para la selección de sondas de ácidos nucléicos. La patente internacional WO 01/05935 está relacionada con el diseño de sondas iterativas y perfiles de expresión detallados con matrices de síntesis in-situ flexibles. La patente internacional WO02/42485 está relacionada con métodos y productos de programas de ordenador para seleccionar sondas de ácidos nucléicos. La patente americana EE.UU 2004/0101846 se refiere a métodos para la identificación de secuencias adecuadas para uso en matrices de ácidos nucleicos.

Mei et al (2003) Proc. Natl. Acad. Sci EEUU 100 (20) :11237-11242 se refiere a una selección de sondas para matrices de oligonucleótidos de alta densidad.

Breve compendio de la invención

La presente invención se resume como un método para optimizar las sondas de hibridación de oligonucleótidos para uso en la investigación básica y clínica. La premisa que subyace a esta estrategia de optimización es que las sondas que presentan intensidades de señal correspondientes a diluciones seriadas de una muestra genómica, y que presentan una intensidad de señal fuerte y constante están bien adaptadas para su uso como sondas optimizadas para una variedad de técnicas de hibridación. En particular, la invención proporciona un método para optimizar sondas de oligonucleótidos para su uso en técnicas de hibridación de micromatrices.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para la optimización de sondas de oligonucleótidos para su utilización en ensayos basados en hibridación, donde dicho método incluye las siguientes etapas:

a) proporcionar una pluralidad de sondas de oligonucleótidos en una matriz de hibridación,

b) proporcionar diluciones seriadas de una muestra genómica, en donde la muestra genómica está marcada

c) hibridar la muestra genómica marcada y diluida en serie con las sondas en la matriz, de tal manera que se produzca una intensidad de señal para cada una de las sondas, en donde la etapa de hibridación se lleva a cabo una vez por lo menos

d) generar computacionalmente los datos de la regresión ponderada a partir de la intensidad de la señal producida por cada una de las sondas

e) identificar las sondas optimizadas a partir de una pluralidad de sondas de oligonucleótidos en una matriz de hibridación para uso en el ensayo utilizando un algoritmo de selección de sondas; en donde las sondas muestran intensidades que corresponden a las diluciones seriadas de la muestra genómica, son reproducibles y están fuertemente relacionadas con las sondas no optimizadas.

Un aspecto de la invención prevé que las sondas de oligonucleótidos sean ADN o ARN.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para la optimización de las sondas para cualquier ensayo basado en hibridación seleccionado del grupo que consiste en micromatrices, ensayos basados en esferas, ensayos de genotipado y ensayos de ARNi.

Un aspecto adicional de la invención consiste en utilizar el método de la invención en la optimización de las sondas utilizadas en los campos de la genómica, farmacogenómica, descubrimiento de fármacos, caracterización de alimentos, genotipado, diagnóstico, monitorización de la expresión génica, perfilado de la diversidad genética, ARNi, secuenciación del genoma completo y descubrimiento de polimorfismos, o cualquier otra aplicación que implique la detección de una alteración genética que implique una amplificación o deleción en un cromosoma.

Otras ventajas y características de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción.

Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos

FIG. 1 es un diagrama de Venn que muestra una comparación de los grupos de sondas originales y óptimas que indica que la selección inicial del rango in silico se puede mejorar con los datos empíricos de hibridación.

FIG. 2 es una representación gráfica de una pendiente frente a la representación de la intensidad de la señal que muestra que las sondas más luminosas no son siempre las mejores para medir el cambio en la concentración de ADN.

FIG. 3 es una representación gráfica de un r2 frente a la representación de la intensidad de la señal que muestra que las sondas más luminosas no son siempre las más reproducibles.

FIG. 4 es una representación gráfica de una pendiente frente a un valor r2 de la línea de regresión ponderada para las sondas individuales... [Seguir leyendo]

1. Un método para optimizar sondas de oligonucleótidos para uso en un ensayo de hibridación, donde dicho método comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una pluralidad de sondas de oligonucleótidos en una matriz de hibridación;

b) proporcionar diluciones seriadas de una muestra genómica, en donde la muestra genómica está marcada;

c) hibridar la muestra genómica marcada y diluida en serie con las sondas en la matriz, de tal manera que se produce una intensidad de señal para cada una de las sondas, en donde la etapa de hibridación se lleva a cabo una vez por lo menos;

d) generar computacionalmente los datos de la regresión ponderada a partir de la intensidad de la señal producida por cada una de las sondas; e

e) identificar las sondas optimizadas a partir de una pluralidad de sondas de oligonucleótidos en una matriz de hibridación para uso en el ensayo utilizando un algoritmo de selección de sondas; donde las sondas que muestran intensidades que corresponden a las diluciones seriadas de la muestra genómica, son reproducibles, y están fuertemente relacionadas con sondas no optimizadas

2. El método de la reivindicación 1, en el que las sondas de oligonucleótidos son ADN o ARN.

3.El método de la reivindicación 2, en el que los ensayos basados en hibridación se seleccionan del grupo que consiste en ensayos basados en micromatrices, ensayos basados en esferas, ensayos de genotipado, y ensayos de RNAi.

4. El método de la reivindicación 3, en el que los ensayos basados en hibridación se realizan en los campos de la genómica, farmacogenómica, descubrimiento de fármacos, caracterización de alimentos, genotipado, diagnóstico, monitorización de la expresión génica, perfilado de diversidad genética, secuenciación de genoma completo y descubrimiento de polimorfismos, o cualquier otra aplicación que implique la detección de alteraciones genéticas que implican una amplificación o deleción en un cromosoma.

5. El método de la reivindicación 1, en el que el algoritmo de selección de sondas para identificar las sondas optimizadas es un algoritmo de selección de rango.

6. El método de la reivindicación 5, en el que el algoritmo de selección de rango para identificar las sondas optimizadas comprende calcular una puntuación para cada sonda utilizando el criterio que comprende la ponderación de la pendiente, el coeficiente de correlación ponderado, la intensidad y la ponderación posicional.

7. El método de la reivindicación 1, en el que el ensayo basado en hibridación es un ensayo basado en micromatrices.