Conjunto de marcadores tumorales.

Procedimiento de detección de los marcadores del cáncer de tiroides en una muestra que comprende detectar lapresencia o medir la cantidad de la ocurrencia del ARNm de al menos 3 marcadores tumorales seleccionados entrelos marcadores tumorales PI-1 a PI-33 en la muestra utilizando oligonucleótidos específicos para ácidos nucleicosmarcadores tumorales

Conjunto de marcadores tumorales La presente invención se refiere al campo del diagnóstico del cáncer y los medios diagnósticos para ello.

Los nódulos tiroideos son endémicos en zonas deficientes en yodo, del tipo de las regiones alpinas de Europa, en las que tienen una prevalencia del 10-20%. Se clasifican por su histología en 2 tipos benignos, bocio nodular (SN) Adenoma Folicular de Tiroides (FTA) y las entidades neoplásicas malignas Carcinoma Folicular de Tiroides (FTC) , Carcinoma Papilar de Tiroides (PTC) , Carcinoma Medular de Tiroides (MTC) y Carcinoma Anaplásico de Tiroides (ATC) . Convencionalmente, la discriminación entre nódulos tiroides benignos y malignos se lleva a cabo mediante gammagrafía y aspiración por boquilla fina seguida por histología. A pesar de los muchos avances en el diagnóstico y el tratamiento de los nódulos tiroideos y el cáncer de tiroides, estos procedimientos tienen una carencia bien conocida es especificidad, particularmente para la discriminación entre FTA y FTC, que conduce a que un gran número de pacientes sean tratados de forma innecesaria para la enfermedad maligna Dadas las limitaciones diagnósticas de los diversos procedimientos, en particular, la aspiración por boquilla seguida por citología, múltiples investigadores han llevado a cabo estudios de perfilación de la expresión con la esperanza de identificar nuevas herramientas diagnósticas. Dichos análisis intentan identificar los genes expresados de forma diferencial con un importante papel en el desarrollo o progresión de la enfermedad utilizando tecnologías de perfilación de la expresión a nivel de transcrito a gran escala tales como micromatrices de ADNc, matrices de oligonucleótidos y Análisis en Serie de la Expresión Génica (SAGE) . Normalmente, se identifican docenas o cientos de genes, muchos de los cuales se espera que sean falsos positivos, y solo una pequeña útil como marcadores diagnósticos/de pronóstico o dianas terapéuticas (Griffith y col., J Clin Oncol 24 (31) : 5043-5051 (2006) ) .

En otros tipos de cáncer se ha mostrado que la perfilación de la expresión génica puede añadir un valor sustancial a la discriminación de las diferentes entidades tumorales clínicamente relevantes. El documento US 2006/183141 A describe, por ejemplo, la clasificación de marcadores tumorales a partir de una firma nuclear de respuesta en suero. Diferentes estudios han intentado clasificar las diferentes entidades del carcinoma de tiroides sobre la base de sus perfiles de expresión génica donde cada uno de los cuales discrimina entre 2 de 5 entidades. Sin embargo, los estudios bien no tienen o bien tienen muy pocos genes en común y aplicar un clasificador de un estudio a los datos de otro estudio da como resultado generalmente malos resultados de clasificación.

Es una meta de la presente invención proporcionar marcadores distintivos fiables para el diagnóstico del cáncer, en particular para distinguir nódulos tiroideos benignos procedentes de carcinoma folicular de tiroides maligno (FTC) y carcinoma papilar de tiroides (PTC) .

Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para la detección de marcadores del cáncer de tiroides en una muestra, que comprende detectar la presencia o la cantidad medida de la incidencia del ARNm de al menos 3 marcadores tumorales seleccionados entre los marcadores tumorales PI-1 a PI-33 en la muestra utilizando oligonucleótidos específicos de los ácidos nucleicos de los marcadores tumorales. Estos marcadores tumorales están relacionados con diferentes genes que se expresan de manera anómala en tumores y que se proporcionan en la tabla 1 y se pueden identificar mediante su firma de identificación génica, su nombre descriptivo del gen, pero de forma más ambigua por su UniGenID o su número de acceso que se refiere a secuencias específicas en las bases de datos de secuencias habituales tales como NCBI GenBank, la base de datos EMBL-EBI, EnsEMBL o el Banco de datos de ADN de Japón. Se proporcionan marcadores tumorales adicionales en las tablas 2 a 6. Estos marcadores se han identificado en forma de conjuntos preferidos (PI a PV, FI) .

Tabla 1: Conjunto P1-1 a PI-33 marcador de PCT

Número P I gen marcador Descripción del gen Nº de acceso. UniGeneID

1 BBS9 Síndrome 9 de Bardet-Biedl NM_198428 NM_001033605 NM_001033604 NM_014451 Hs.372360

2 C13ºrf1 Marco de lectura abierto 1 del cromosoma 13 NM_020456 Hs.44235

3 CBFA2T3 Factor de unión a núcleo, dominio enano, subunidad alfa 2 NM_005187 NM_175931 Hs.513811

4 CDT1 Licenciamiento de la cromatina y factor de replicación DANN 1 NM_030928 Hs.122908

5 CRK Homólogo del oncogén CT10 del virus del sarcoma V-crk (aves) NM_016823 NM_005206 Hs.638121

6 CTPS Sintasa de CTP NM_001905 Hs.473087

(continuación)

Número P I gen marcador Descripción del gen Nº de acceso. UniGeneID

7 DAPK2 Proteína quinasa 2 asociada a muerte NM_014326 Hs.237886

8 EIF5 Factor 5 de inicio de la traducción eucariota NM_001969 NM_183004 Hs.433702

9 EREG Epirequlina NM_001432 Hs.115263

10 GK Glicerol quinasa NM_203391 NM_000167 Hs.1466

11 GPATCH8 Dominio del parche G que contiene 8 NM_001002909 Hs.463129

12 HDGF Factor de crecimiento derivado de hepatoma (proteína de tipo 1 del grupo de alta movilidad) NM_004494 Hs.506748

13 IRF2BP1 Proteína 1 de unión al factor 2 regulador del interferón NM_015649 Hs.515477

14 KRT83 Queratina 83 NM_002282 Hs.661428

15 MYOD1 Diferenciación miogénica 1 NM_002478 Hs.181768

16 NME6 Proteína expresada en células 6 no metastásicas, (nucleósido-difosfato quinasa) NM_005793 Hs.465558

17 POLE3 Polimerasa (dirigida a DNA) , épsilon 3 (subunidad p17) NM_017443 Hs.108112

18 PPP1R13B Proteína fosfatasa 1, subunidad reguladora (inhibidora) 13B NM_015316 Hs.436113

19 PRPH2 Periferina 2 (degeneración retinal, lenta) NM_000322 Hs.654489

20 RASSF7 Asociación Ras (familia 7 del dominio (RaIGDS/AF-6) NM_003475 Hs.72925

21 ROCK2 Proteína quinasa 2 que contiene cola enrollada asociada a Rho NM_004850 Hs.591600

22 RTN1 Reticulón 1 NM_021136 NM_206857 NM_206852 Hs.368626

23 S100B Proteína B de unión a calcio S100 NM_006272 Hs.422181

24 SLIT2 Homólogo de hendidura 2 (Drosophila) NM_004787 Hs.29802

25 SNRPB2 Polipéptido B de la ribonucleoproteína nuclear pequeña NM_003092 NM_198220 Hs.280378

26 SPAG7 Antígeno 7 asociado a esperma NM_004890 Hs.90436

27 STAU1 Homólogo 1 de la proteína Staufende de unión a ARN (Drosophila) NM_017453 NM_001037328NM_ 004602 NM_01745 NM_017454 Hs.596704

28 SUPT5H Supresor del homólogo Ty 5 (S. cerevisiae) NM_003169 Hs.631604

29 TBX10 Secuencia T10 NM_005995 Hs.454480

30 TLK1 Quinasa 1 de tipo desordenado NM_012290 Hs.655640

31 TM4SF4 Miembro de la familia seis de transmembrana 4 L NM_004617 Hs.133527

32 TXN Tioredoxina NM_003329 Hs.435136

33 UFD1L Degradación de tipo 1 de fusión a ubiquitina (levadura) NM_005659 NM_001035247 Hs.474213

Tabla 2: Conjunto PII a PII-64 del marcador de PTC

Número P II- Gen marcador Descripción del gen Nº de acceso. UniGeneID

1 ADH1B Alcohol deshidrogenasa IB (clase I) , polipéptido beta NM_000668 Hs.4

2 AGR2 Homólogo 2 del gradiente anterior (Xenopus laevis) NM_006408 Hs.530009

3 AGTR1 Receptor de tipo 1 de la Angiotensina II NM_031850 NM_004835 NM_009585 NM 032049 Hs.477887

4 AGTR1 Receptor de tipo 1 de la Angiotensina II NM_000685 Hs.654382

5 ALDH1A 1 Miembro A1 de la familia de la aldehído deshidrogenasa 1 NM_000689 Hs.76392

6 ALDH1A 3 Miembro A3 de la familia de la aldehído deshidrogenasa 1 NM_000693 Hs.459538

7 AMIG02 Molécula de adhesión al dominio 2 de tipo Ig NM_181847 Hs.121520

8 ATP2C2 Miembro 2 de tipo 2C del transportador de Ca++ de la ATPasa NM_014861 Hs.6168

9 BID Agonista de muerte del dominio de interacción BH3 NM_197966 NM_001196 NM_197967 Hs.591054

10 C7ºrf24 Marco de lectura abierto 24 del cromosoma 7 NM_024051 Hs.530024

11 CA4 Anhidrasa carbónica IV NM_000717 Hs.89485

12 CCL21 Ligando 21 de la quimioquina (motivo C-C) NM_002989 Hs.57907

13 CD55 Factor de aceleración de la desintegración de la molécula para el complemento (Grupo sanguíneo Cromer) NM_000574 Hs.527653

14 CDH16 Caderina 16, caderina KSP NM_004062 Hs.513660

15. CDH3 Caderina 3, P-caderina P de tipo 1 (placental) NM_133458 NM_001793 Hs.461074

16 CFI Factor I del complemento NM_000204 Hs.312485

17 CH13Ll 1 Quitinasa 3-de tipo 1 (glicoproteína 39 de cartílago) NM_001276 Hs.382202

18 CHST2 Carbohidrato (N-acetilglucosamina-6-0) sulfotransferasa... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de detección de los marcadores del cáncer de tiroides en una muestra que comprende detectar la presencia o medir la cantidad de la ocurrencia del ARNm de al menos 3 marcadores tumorales seleccionados entre los marcadores tumorales PI-1 a PI-33 en la muestra utilizando oligonucleótidos específicos para ácidos nucleicos marcadores tumorales.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra comprende células, preferentemente células de mamífero, de forma particularmente preferida, células humanas.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la detección o la medida se lleva a cabo mediante el análisis de la expresión del ARN, preferentemente mediante micromatriz o PCR cuantitativa, preferentemente por detección de tejido mediante micromatriz, detección de ARNm mediante micromatriz, ensayos multiplexados, o análisis del ADN, matrices de hibridación genómica comparativa (CGH) o análisis de polimorfismo de nucleótido único (SNP) .

4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los oligonucleótidos son inmovilizados sobre un soporte sólido.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, caracterizado porque los oligonucleótidos son inmovilizados en la forma de una micromatriz

6. Un procedimiento in vitro de diagnóstico del cáncer seleccionado entre cáncer papilar de tiroides o cáncer folicular de tiroides en un paciente, que comprende proporcionar una muestra de células procedente de un paciente, detectar los marcadores tumorales de acuerdo con un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comparar los valores de la señal medidos de los marcadores tumorales con los valores de los marcadores tumorales en muestras sanas y diagnosticar el cáncer si (a) más de un 50%, preferentemente más de un 60%, de forma más preferida más de un 70%, lo más preferido más de un 80%, de los valores difieren en comparación con los valores de las muestras sanas en al menos la desviación estándar, preferentemente dos veces la desviación estándar, incluso más preferentemente tres veces la desviación estándar del procedimiento de medida y/o (b) más de un 50%, preferentemente más de un 60%, de forma más preferida más de un 70%, lo más preferido más de un 80%, de los valores de la muestra difieren en comparación con los valores de las muestras sanas en al menos un factor de 1, 5.

7. Procedimiento in vitro para el diagnóstico del cáncer seleccionado entre cáncer papilar de tiroides o cáncer folicular de tiroides en un paciente, que comprende proporcionar una muestra de células, procedentes del paciente, detectar los marcadores tumorales de acuerdo con un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comparar los valores de la señal medidos de los marcadores tumorales con los valores de los marcadores tumorales en muestras de cáncer mediante un procedimiento de identificación que comprende

! proporcionar datos de la expresión génica, preferentemente brutos, datos de expresión génica no procesados, sobre múltiples genes potenciales específicos de la enfermedad de al menos dos conjuntos de datos de la expresión diferentes, ! determinar los genes comunes de los conjuntos de datos, ! normalizar cada conjunto de datos de la expresión génica, preferentemente mediante normalización inferior

o por cuantil, ! combinar los conjuntos de datos de la expresión génica en un conjunto de datos combinados, y normalizar preferentemente el conjunto de datos combinados, e integrar el conjunto de datos combinados, ! determinación de los genes del conjunto de datos combinados en el centroide comprimido más cercano, que incluye la determinación del valor del error validado en cruzado de asignar los genes a la enfermedad y minimizar el valor del error reduciendo el número de miembros del conjunto de datos combinados, preferentemente normalizados.

en el que los genes de los conjuntos de datos reducidos son los marcadores específicos para la enfermedad, siendo de manera preferible un trastorno genético, preferentemente un trastorno con la expresión génica alterada, se prefiere de forma particular cáncer, y diagnosticar el cáncer en el centroide comprimido más cercano de los valores de la muestra del paciente para al menos un 50% de marcadores del conjunto está comprendido dentro de la desviación estándar, preferentemente dos veces la desviación estándar, incluso de forma más preferida tres veces la desviación estándar, del procedimiento de medida del centroide comprimido más cercano de los marcadores tumorales identificados con las muestras del cáncer.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, caracterizado porque los datos de la expresión comprenden los datos de al menos dos conjuntos de datos diferentes de la micromatriz, en particular con los sesgos específicos.

9. El procedimiento de la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque la etapa de combinación se lleva a cabo mediante una combinación por etapas de dos conjuntos de bases de la expresión génica e integración de los datos combinados, preferentemente mediante DWD.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque cada conjunto de datos de la expresión comprende los datos de al menos 10, preferentemente al menos 20 de forma más preferida al menos 30, incluso de forma más preferida al menos 40, lo más preferido al menos 50, genes diferentes.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque la etapa de determinación se repite en un conjunto combinado sin los genes determinados en una etapa de determinación previa y/o la etapa de determinación comprende la determinación de un umbral maximizado de la diferencia entre el valor de la expresión normalizada para cada gen al centroide mediante la validación cruzada, y en el que los genes con valores de expresión normalizados por debajo del umbral son eliminados del conjunto reducido.

Fig. 1

Fig.2

Fig-3

Fig. 4

Fig. 5