Un método para proporcionar una variante de polipéptido objetivo con una estabilidad mejorada en comparación con un polipéptido objetivo parental,

método que comprende: (a) proporcionar moléculas de mRNA, comprendiendo cada molécula de mRNA una secuencia de nucleótidos que codifica una variante del polipéptido objetivo y que carece de un codón de parada en marco; (b) incubar las moléculas de mRNA bajo unas condiciones para la traducción ribosómica de las moléculas de mRNA para producir variantes codificadas del polipéptido objetivo, por lo cual se forman complejos que comprenden mRNA, la variante codificada del polipéptido objetivo y el ribosoma; (c) poner los complejos en contacto con un receptor, ligando o miembro específico de par ligante que se unen al polipéptido objetivo parental y seleccionar uno o más complejos cada uno de los cuales presenta una variante del polipéptido objetivo capaz de unirse al receptor, ligando o miembro específico de par ligante bajo las condiciones de la selección; caracterizado por que se aplica una presión de selección en cuanto a estabilidad, ditiotreitol (DTT), durante la traducción en la operación (b) y se continúa aplicando durante la selección en la operación (c), y se aplican otras presiones de selección en cuanto a estabilidad, HIC y temperatura ambiental, durante la selección en la operación (c), o se aplican después de la traducción en la operación (b) y se eliminan antes de poner los complejos en contacto con el receptor, ligando o miembro específico de par ligante en la operación (c); y (d) determinar la estabilidad de la variante o las variantes del polipéptido objetivo seleccionadas, por lo que se obtienen una o más variantes del polipéptido objetivo con una estabilidad mejorada en comparación con la del polipéptido objetivo parental.

Metodo de presentación en ribosomas o presentación en mRNA con selección en cuanto a una estabilidad aumentada de la proteina El presente invento se refiere a metodos para seleccionar, obtener o producir variantes polipeptidicas con una 5 estabilidad mejorada. Tambien se refiere a la fabricación y el uso de las variantes despues de la selección, tal como, por ejemplo, en terapia.

En el invento se emplea una tecnologia de presentación que lleva incorporada traducción in vitro y enlace no covalente entre el genotipo, tal como RNA, y el fenotipo codificado, tal como un polipeptido de interes, para seleccionar variantes polipeptidicas que tengan una estabilidad mejorada en comparación con un polipeptido parental y que conserven su actividad funcional.

La presentación y selección en ribosomas o polisomas implica la construcción de bancos de acido nucleico, exploración en cuanto a la unión, e identificación de elementos ligantes de interes. El banco se prepara sintetizando una colección de diversas secuencias de DNA que son luego transcritas para producir una colección de mRNAs. Se utiliza la traducción in vitro para generar los polipeptidos o proteinas codificados presentados, y se seleccionan las interacciones ligantes deseables utilizando un antigeno diana inmovilizado. El mRNA que codifica los elementos ligantes puede ser utilizado para preparar cDNA, el cual puede ser luego multiplicado, y se puede repetir el proceso para enriquecer la población en cuanto a genes que codifican agentes ligantes. Las proteinas seleccionadas pueden ser identificadas mas tarde mediante clonación de secuencias de codificación individuales y secuenciación de DNA.

Esta tecnologia ha sido ampliamente revisada [Hanes et al. (2000) , Meth. Enzymol. 328, 403-430; PlOckthun et al. 20 (2000) , Adv. Prot. Chem. 55, 367-403; Lipovsek y PlOckthun (2004) , J. Immunological Methods 290, 51-67].

Esta tecnologia ha sido utilizada para la presentación de fragmentos de anticuerpo, peptidos y diversas proteinas, incluyendo proteinas periplasmicas y citoplasmicas tales como º-lactamasa y proteinas con repeticiones de anquirina.

La recuperación de mRNA de complejos polis6micos fue comunicada por vez primera en 1973 en un articulo en que se describia un protocolo para capturar un mRNA que codificaba una cadena L de inmunoglobulina de ratón, usando anticuerpos y oligotimidina inmovilizada [Schechter (1973) , PNAS USA 70, 2256-2260]. Payvar y Schimke [Eur. J. Biochem. (1979) 101, 271-282] realizaron mejoras a los protocolos para inmunoprecipitación de polisomas y, despues de la inmunoprecipitación de polisomas usando un anticuerpo monoclonal, se obtuvieron clones de cDNA para la cadena pesada de antigenos HLA-DR [PNAS USA (1982) 79, 1844-1848]. Kawasaki (Patente de EE.UU. nO

5.643.768 y Patente de EE.UU. nO 5.658.754, EP-B-0494955) propuso y patent6 la producción de bancos de anticuerpos mediante presentación en ribosomas.

Ha habido diversos ejemplos sobre el uso de presentación en ribosomas utilizando sistemas de traducción eucarióticos o procarióticos. La primera demostración de la selección de ligandos peptidicos usando un extracto de E. coli fue realizada por Mattheakis et al. [PNAS USA (1994) 91, 9022-9026 y Methods Enzymol. (1996) 267, 195

207]. Este grupo demostró la selección de ligandos peptidicos que son similares a epitopos peptidicos conocidos de un anticuerpo dado, utilizando el anticuerpo como un sustrato de selección. Se han identificado ligandos peptidicos de alta afinidad que se unen al antigeno especifico de la pr6stata, utilizando la selección en polisomas a partir de bancos peptidicos usando un sistema de traducción de extracto de germen de trigo [Gersuk et al. (1997) , Biotech. and Biophys. Res. Comm. 232, 578-582]. Se comunic6 la selección de fragmentos de anticuerpo funcionales usando un sistema de traducción de E. coli disenado para la producción aumentada de complejos ternarios y permitiendo la formación de enlaces disulfuro [Hanes y Pluckthun, PNAS USA (1997) 94, 4937-4942]. Este proyecto experimental ha sido posteriormente utilizado para seleccionar anticuerpos de un banco murino, y se mostró que tiene lugar una maduración de la afinidad durante la selección debido al efecto combinado de errores de PCR y selección. Se obtuvo un fragmento scFv con una constante de disociación de aproximadamente 10-11 M [Hanes et al., PNAS USA

45 (1998) 95, 14.130-50]. Tambien se ha demostrado el enriquecimiento en anticuerpos especificos a partir de poblaciones mixtas usando extractos de lisados de reticulocitos de conejo [He y Taussig (1997) NAR, 5132-5234].

El presente invento proporciona una metodologia que es aplicable a la tecnologia de presentación que lleva incorporada traducción in vitro y enlace no covalente entre el genotipo, tal como RNA, y el fenotipo codificado, tal como un polipeptido de interes, para la selección de variantes del polipeptido objetivo con una estabilidad mejorada 50 y una funcionalidad conservada en comparación con un polipeptido parental. Los metodos del invento llevan incorporadas diversas caracteristicas no previamente utilizadas conjuntamente en la presentación en ribosomas.

En realizaciones del presente invento, se emplean simultaneamente dos o mas presiones de selección en cuanto a estabilidad, lo que permite la selección de polipeptidos estables como se expone en las reivindicaciones.

Una presión de selección en cuanto a estabilidad puede ser cualquier factor que se pueda utilizar en una tecnologia 55 de presentación que lleva incorporada traducción in vitro y enlace no covalente entre el genotipo, tal como RNA, y el fenotipo codificado, tal como un polipeptido de interes, que permita la selección de un polipeptido variante en lo relativo a su estabilidad. La estabilidad puede ser generalmente definida como la tendencia de una molecula a existir

en su estado plegado y activo. Una presión de selección en cuanto a estabilidad puede alterar o evitar una plegadura polipeptidica correcta, de modo que no se alcance un estado activo o completamente activo. Una presión de selección en cuanto a estabilidad puede afectar a la capacidad de un polipeptido para permanecer en su estado plegado y activo. Una presión de selección en cuanto a estabilidad puede permitir diferenciar en cierto modo entre polipeptidos que estan en un estado plegado y activo y aquellos que no lo estan.

Por ejemplo, una presión de selección en cuanto a estabilidad puede ser un agente desnaturalizante quimico, tal como urea, guanidina HCl (GuHCl) o tiocianato, por ejemplo, tiocianato s6dico. Una presión de selección en cuanto a estabilidad puede ser un agente reductor, tal como ditiotreitol (DTT) , hidrocloruro de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) , mercaptoetanol o glutatión. Una presión de selección en cuanto a estabilidad puede ser un agente desnaturalizante fisico, tal como el pH o la temperatura, en particular una temperatura aumentada. Una presión de selección puede ser una proteasa o una enzima capaz de degradar proteinas. Una presión de selección puede ser la disminución de chaperones, o los pequenos inhibidores moleculares de la plegadura de proteinas.

Una presión de selección en cuanto a estabilidad puede ser el uso de cromatografia por interacción hidrófoba (HIC; del ingles, hydrophobic interaction chromatography) .

La cromatografia por interacción hidrófoba (HIC) es una tecnica para la separación de biomoleculas basada en diferencias en su hidrofobia superficial. Se han utilizado tecnicas de HIC como parte de estrategias para purificación de proteinas y tambien como una herramienta analitica para la detección de cambios conformacionales en proteinas [revisadas por Queiroz et al. (2001) , J. Biotech. 87, 143-159; Fulton y Vanderburgh (1996) , Biomolecule Chromatography PerSeptive Biosystems]. La HIC se basa en una atracción hidrófoba entre la matriz para HIC y las moleculas proteicas. La matriz para HIC consiste en pequenos grupos apolares (butilo, octilo o fenilo) fijados a una estructura polimera hidrófila (por ejemplo, agarosa o dextrano reticulados) . Muchas proteinas, que generalmente son consideradas hidrófilas, tienen tambien numeros suficientes de grupos hidrófobos que permiten la interacción con la matriz para HIC. La HIC es lo suficientemente sensible para detectar la interacción con grupos apolares normalmente enterrados dentro de la estructura terciaria de la proteina pero expuestos a causa de una plegadura incorrecta. La intensidad de la interacción depende del tipo de matriz, el tipo y la concentración de sal, el pH, aditivos y... [Seguir leyendo]

1. Un metodo para proporcionar una variante de polipeptido objetivo con una estabilidad mejorada en comparación con un polipeptido objetivo parental, metodo que comprende:

(a) proporcionar moleculas de mRNA, comprendiendo cada molecula de mRNA una secuencia de nucleótidos que codifica una variante del polipeptido objetivo y que carece de un codón de parada en marco;

(b) incubar las moleculas de mRNA bajo unas condiciones para la traducción ribos6mica de las moleculas de mRNA para producir variantes codificadas del polipeptido objetivo, por lo cual se forman complejos que comprenden mRNA, la variante codificada del polipeptido objetivo y el ribosoma;

(c) poner los complejos en contacto con un receptor, ligando o miembro especifico de par ligante que se unen al polipeptido objetivo parental y seleccionar uno o mas complejos cada uno de los cuales presenta una variante del polipeptido objetivo capaz de unirse al receptor, ligando o miembro especifico de par ligante bajo las condiciones de la selección;

caracterizado porºque se aplica una presión de selección en cuanto a estabilidad, ditiotreitol (DTT) , durante la traducción en la operación (b) y se continua aplicando durante la selección en la operación (c) , y se aplican otras presiones de selección en cuanto a estabilidad, HIC y temperatura ambiental, durante la selección en la operación (c) , o se aplican despues de la traducción en la operación (b) y se eliminan antes de poner los complejos en contacto con el receptor, ligando o miembro especifico de par ligante en la operación (c) ; y

(d) determinar la estabilidad de la variante o las variantes del polipeptido objetivo seleccionadas, por lo que se obtienen una o mas variantes del polipeptido objetivo con una estabilidad mejorada en comparación con la del polipeptido objetivo parental.

2. Un metodo de acuerdo con la Reivindicación 1, en que la estabilidad se determina comparando la capacidad de la variante o las variantes del polipeptido objetivo seleccionadas para unirse al receptor, ligando o miembro especifico de par ligante en la presentación cuando se producen en presencia y ausencia de DTT.

3. Un metodo de acuerdo con la Reivindicación 1, en que la estabilidad se determina comparando la agregación de la variante o las variantes del polipeptido objetivo seleccionadas con la del polipeptido objetivo parental.

4. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que las moleculas de mRNA para incubación en el sistema de traducción se proporcionan mutando acido nucleico que codifica el polipeptido objetivo parental.

5. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que las moleculas de mRNA para incubación en el sistema de traducción se proporcionan por medio de reacciones RT-PCR en que al menos un cebador de RT-PCR es un cebador mutagenico que codifica una diversidad de secuencias diferentes para inclusión en una región definida de la secuencia de nucleótidos que codifica una variante del polipeptido objetivo.

6. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas recuperar mRNA de un complejo seleccionado.

7. Un metodo para producir una variante polipeptidica, metodo que comprende:

llevar a cabo el metodo de acuerdo con la Reivindicación 6;

multiplicar y copiar el mRNA recuperado en DNA que codifica la variante del polipeptido objetivo seleccionada;

proporcionar el DNA en un sistema de expresión para la producción de un producto, producto que es la variante del polipeptido objetivo seleccionada o una cadena polipeptidica de la variante del polipeptido objetivo seleccionada; y aislar o purificar el producto.

8. Un metodo para producir una variante polipeptidica, metodo que comprende:

llevar a cabo el metodo de acuerdo con la Reivindicación 6;

multiplicar y copiar el mRNA recuperado en DNA que codifica la variante del polipeptido objetivo seleccionada; y proporcionar el DNA que codifica la variante del polipeptido objetivo seleccionada o una cadena polipeptidica de la variante del polipeptido objetivo seleccionada, dentro de una secuencia de nucleótidos para proveer una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina de fusión que comprende la variante del polipeptido objetivo seleccionada, o una cadena polipeptidica de la variante del polipeptido objetivo seleccionada, fusionada con aminoacidos adicionales;

proporcionar el DNA que comprende dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteina de fusión en un sistema de expresión para la producción de un producto, producto que es la proteina de fusión; y aislar o purificar el producto.

º. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el polipeptido objetivo parental es una molecula de anticuerpo.

1º. Un metodo de acuerdo con la Reivindicación 9, en que la molecula de anticuerpo es una molecula de anticuerpo de cadena sencilla.

11. Un metodo de acuerdo con la Reivindicación 10, en que la molecula de anticuerpo es una molecula de scFv, VH, Fd o dAb.

12. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en que el polipeptido objetivo parental es un miembro de la familia de proteinas con haces de cuatro a-helices antiparalelas.

13. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en que el polipeptido objetivo parental es 15 un dominio extracelular de un receptor complejo.

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