Uso de un anticuerpo monoclonal codificado por un clon depositado en la ATCC con el número de acceso PTA-4621 para identificar una célula que expresa CD44 in vitro.

Mediación de la citotoxicidad de células que muestran expresión superficial de CD44.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al diagnóstico y el tratamiento de enfermedades cancerosas, en particular a la mediación de la citotoxicidad de células tumorales; y lo más particularmente, al uso de anticuerpos modificadores de enfermedad cancerosa (CDMAB), opcionalmente en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos, como medio para iniciar la respuesta citotóxica. La invención se refiere además a ensayos de unión que utilizan el CDMAB de la presente invención.

Antecedentes de la invención

La obtención de anticuerpos monoclonales contra leucocitos humanos dio lugar al descubrimiento del antígeno CD44; una glucoproteína monocatenaria que une ácido hilaurónico (HA) expresada en una amplia variedad de tejido normal y en todos los tipos de células hematopoyéticas. Originalmente, se asoció con la activación y la migración de linfocitos. Actualmente, su papel fisiológico supuesto incluye también la activación de genes inflamatorios, la modulación del ciclo celular, la inducción de la proliferación celular, la inducción de la diferenciación y el desarrollo, la inducción de la reorganización del citoesqueleto y la migración celular y la supervivencia/resistencia celular a la apoptosis.

En seres humanos, la única copia del gen CD44 se sitúa en el brazo corto del cromosoma 11, 11p13. El gen contiene 19 exones; los primeros 5 son constantes, los 9 siguientes son variantes, los 3 siguientes son constantes y los 2 últimos son variantes. El ayuste diferencial puede dar lugar a más de 1000 isoformas diferentes. Sin embargo, actualmente, sólo se han identificado varias docenas de variantes naturales.

La glucoproteína CD44 estándar consta de un dominio N-terminal extracelular (que incluye una secuencia líder de 20 a.a. y una región próxima a la membrana (85 a.a.) (270 a.a.), una región trasmembranaria (21 a.a.) y una cola citoplásmica (72 a.a.). La región extracelular contiene también un módulo de enlace en el extremo N-terminal. Esta región tiene 92 a.a. de longitud y muestra homología con otras proteínas de enlace que unen HA. Existe una gran homología entre las formas humana y de ratón de CD44. Las formas variantes de la proteína se insertan en el extremo carboxi del exón 5 y se sitúan extracelularmente cuando se expresan.

También se produce de forma natural una forma soluble en suero de CD44 y puede surgir, bien de un codón de terminación (dentro de la región variable) o bien de la actividad proteolítica. La activación de células a partir de una variedad de estímulos, incluido TNF-α, da como resultado la propagación del receptor de CD44. La propagación del receptor también se ha observado con células tumorales y puede dar como resultado un incremento de la concentración de CD44 en el suero humano de hasta 10 veces. Una concentración en suero elevada de CD44 sugiere una neoplasia maligna (siendo el cáncer de ovario la excepción).

La forma estándar de CD44 existe con un peso molecular de aproximadamente 37 kD. Las modificaciones postraduccionales incrementan el peso molecular hasta 80-90 kD. Estas modificaciones incluyen glucosilaciones enlazadas en N del extremo amino del dominio extracelular en residuos de asparagina, glucosilaciones enlazadas en O en residuos de serina/treonina en el extremo carboxi del dominio extracelular y adiciones de glucosaminoglucanos. Las variantes de ayuste pueden variar de tamaño entre 80-250 kD.

Se cree que el HA, un polisacárido situado en la matriz extracelular (MEC) en mamíferos, es el ligando principal de CD44. Sin embargo, también se ha descubierto que CD44 une proteínas tales como colágeno, laminina, etc. Parece haber una correlación entre la glucosilación y la unión de HA. El CD44 inactivo (no une HA) tiene los niveles de glucosilación más elevados, el CD44 activo (unido a HA) los más bajos, mientras que el CD44 inducible (no une HA o lo hace de forma débil a no ser que se active por citocinas, anticuerpos monoclonales, factores de crecimiento, etc.) tiene niveles de glucosilación en algún punto entre las formas activa e inactiva.

CD44 puede mediar algunas de sus funciones a través de las rutas de transducción de señales que dependen de la interacción de la célula, el estímulo y el entorno. Algunas de estas rutas incluyen la cascada de señalización de NFκB (implicada en la respuesta inflamatoria), la ruta de transducción de señales de Ras-MAPK (implicada en la activación de la proliferación y el ciclo celular), la familia de proteínas Rho (implicada en la reorganización del citoesqueleto y la migración celular) y la ruta de señalización relacionada con Pl3-K (relacionada con la supervivencia celular). Todas las funciones mencionadas anteriormente están estrechamente relacionadas con el inicio y la progresión de enfermedades tumorales. También se ha implicado a CD44 en el desempeño de un papel en el cáncer a través de una variedad de mecanismos adicionales. Éstos incluyen la presentación de factores de crecimiento, quimiocinas y citocinas mediante proteoglucanos de superficie celular presentes en la superficie celular de CD44 a receptores implicados en las neoplaslas malignas. Asimismo, la degradación intracelular de HA por hialuronidasas lisosómicas tras la internalización del complejo CD44-HA puede incrementar potencialmente la probabilidad de la invasión del tumor y la inducción de la angiogénesis a través de la MEC. Además, se ha demostrado que la transmisión de señales de supervivencia o apoptóticas se produce a través del receptor de CD44 estándar o variable. También se ha sugerido que CD44 está implicado en la diferenciación y la migración celular.

Muchos de estos mecanismos, si no todos, dependen del entorno y de las células y varios dan lugar a resultados variables. Por lo tanto, se requiere más investigación antes de que pueden sacarse conclusiones.

Con el fin de confirmar un potencial papel funcional de CD44 en el cáncer, se llevaron a cabo estudios de la expresión de CD44 para determinar si la expresión diferencial del receptor se correlaciona con la progresión de la enfermedad. Sin embargo, se observaron resultados contradictorios en la mayoría de tipos de tumores y esto se debe probablemente a una combinación de diferencias de reactivos, técnica, clasificación patológica y tipo celular entre los investigadores. El carcinoma de células renales y el linfoma no hodgkiniano parecen ser la excepción en cuanto que los pacientes con tumores que expresan mucho CD44 mostraron, de forma coherente, tiempos de supervivencia menores que sus equivalentes que expresan poco o nada de CD44.

Debido a su asociación con el cáncer, CD44 ha sido la diana del desarrollo de tratamientos antineoplásicos. Todavía existe controversia en cuanto a si son necesarias las formas estándar o variantes de CD44 para la progresión del tumor. Hay datos de animales in vivo para respaldar ambos puntos de vista y, de nuevo, puede depender del tipo de tumor e incluso del tipo celular. Los diferentes enfoques terapéuticos han incluido la inyección de proteínas CD44 solubles, ADNc de hialuronano sintasa, hialuronidasa, el uso de anticuerpos específicos frente a CD44 y CD44 en antisentido. Cada enfoque ha dado lugar a cierto grado de éxito, proporcionando así el respaldo para los tratamientos antineoplásicos anti-CD44.

Se han generado de forma experimental anticuerpos monoclonales específicos frente a CD44, tanto variante como estándar, pero en su mayoría estos anticuerpos no tienen actividad biológica intrínseca, sino que se unen específicamente al tipo de CD44 que reconocen. No obstante, existen algunos que son activos bien in vitro o bien in vivo, pero, en general, no ambos. Se ha demostrado que varios anticuerpos anti-CD44 median acontecimientos celulares. Por ejemplo, se demostró que el anticuerpo murino A3D8, dirigido contra la forma estándar del antígeno CD44 luterano de eritrocito humano, potencia la activación de linfocitos T mediada por CD2 (anticuerpo 9-1) y CD3 (anticuerpo OKT3); otro anticuerpo anti-CD44 tuvo efectos similares. A3D8 indujo también la liberación de IL-1 desde monocitos y la liberación de IL-2 desde linfocitos T. Curiosamente, el uso de A3D8 junto con fármacos tales como daunorrubicina, mitoxantrona y etopósido, inhibió la inducción de la apoptosis en células HL60 y NB4 de LMA anulando la generación del segundo mensajero ceramida. El anticuerpo J173, que no tiene actividad intrínseca y se ... [Seguir leyendo]

1. Uso de un anticuerpo monoclonal codificado por un clon depositado en la ATCC con el número de acceso PTA-4621 para identificar una célula que expresa CD44 in vitro.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho CD44 es un CD44 humano.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho CD44 humano es el CD44 con número de acceso del NCBI gi|2134882.

4. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha célula es una célula tumoral.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha célula tumoral es una célula de piel, mama, ganglio linfático, hueso, tejido blando, cavidad nasal, laringe, pulmón, lengua, glándula parótida, hígado, vesícula biliar, páncreas, esófago, estómago, colon, recto, riñón, vejiga urinaria, próstata, testículos, útero, cuello uterino, tiroides, timo o cerebro.

6. Un procedimiento in vitro de identificación de un tumor humano susceptible de ser tratado con un anticuerpo monoclonal codificado por un clon depositado en la ATCC con número de acceso PTA-4621, que comprende identificar un tumor humano que expresa CD44 usando un anticuerpo monoclonal codificado por un clon depositado en la ATCC con número de acceso PTA-4621.

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho CD44 es el CD44 con número de acceso del NCBI gi|2134882.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en el que dicho tumor es un tumor de piel, mama, ganglio linfático, hueso, tejido blando, cavidad nasal, laringe, pulmón, lengua, glándula parótida, hígado, vesícula biliar, páncreas, esófago, estómago, colon, recto, riñón, vejiga urinaria, próstata, testículos, útero, cuello uterino, tiroides, timo o cerebro.

9. Un ensayo para determinar la presencia de células humanas que expresan CD44 que comprende:

proporcionar un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, codificados por el clon depositado en la ATCC como PTA-4621;

poner en contacto dicho anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo con dicha muestra de células; y

determinar la unión de dicho anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo con dicha muestra de células;

mediante el cual se determina la presencia de células que expresan resto antigénico CD44.

10. Un ensayo de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho CD44 es un CD44 humano.

11. Un ensayo de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho CD44 humano es el CD44 con número de acceso del NCBI gi|2134882.

12. Un ensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que dicha célula es una célula tumoral.

13. Un ensayo de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicha célula tumoral es una célula de piel, mama, ganglio linfático, hueso, tejido blando, cavidad nasal, laringe, pulmón, lengua, glándula parótida, hígado, vesícula biliar, páncreas, esófago, estómago, colon, recto, riñón, vejiga urinaria, próstata, testículos, útero, cuello uterino, tiroides, timo o cerebro.