Bacteria Listeria monocytogenes atenuada que es una Listeria monocytogenes Δ

actAΔinlB, comprendiendo dicha bacteria adicionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno que no es de Listeria, estando dicha molécula de ácido nucleico unida operativamente a una secuencia reguladora capaz de expresar dicho antígeno.

Listeria atenuada para entrar en células no fagocíticas, vacunas que comprenden esta listeria y métodos de uso de las mismas.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

El campo de esta invención se refiere de forma general a las bacterias atenuadas para uso en vacunas. En particular, esta invención se refiere a Listeria monocytogenes atenuada útil para las composiciones de vacuna y para los métodos en los que se utilizan estas vacunas para tratamiento.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se han desarrollado microbios para uso como vacunas que suministran antígenos heterólogos. El suministro de antígenos heterólogos se consigue mediante microorganismos que se han modificado para que contengan secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína o antígeno que procede de una especie diferente. La administración de los antígenos heterólogos es especialmente ventajosa para tratar o prevenir enfermedades o afecciones que son resultado de fuentes especialmente virulentas o letales, tal como cáncer y microorganismos patógenos (por ejemplo, VIH o la hepatitis B) . La inyección de un agente infeccioso nativo o virulento es posiblemente perjudicial para el organismo receptor. Así mismo, una célula cancerosa que aparece esporádicamente en un individuo afectado puede posteriormente propagarse y así mismo puede ser posiblemente perjudicial para el organismo receptor. La administración de los antígenos heterólogos es también especialmente ventajosa cuando la administración de un agente o célula atenuado o muerto se ha comprobado que no resulta exitosa a la hora de desencadenar una respuesta inmunitaria eficaz o cuando no se puede garantizar con una certeza aceptable la atenuación suficiente del agente infeccioso ni de la célula cancerosa. Recientemente se han desarrollado determinadas cepas bacterianas que sirven de vacunas recombinantes. Por ejemplo, se ha demostrado que una vacuna por vía oral de Salmonella atenuada modificada para que exprese el antígeno del circumesporozoíto de Plasmodium berghei protege a los ratones contra la malaria (Aggarwal et al., 1990. J. Exp. Med. 172: 1083) .

Una clase de bacterias que se podría utilizar como vacunas heterólogas son las bacterias intracelulares facultativas. La respuesta inmunitaria a estas bacterias puede ser una respuesta humoral, una respuesta celular, o ambas. Sin embargo, las bacterias intracelulares muertas o los componentes de las bacterias intracelulares podrían no desencadenar una respuesta inmunitaria celular completa (Lauvau et al., 2001, Science, 294: 1735-9) . Estas bacterias pueden pasar parte de su ciclo de vida libre en el aparato circulatorio o el sistema linfático de su hospedador, donde se someten a las respuestas innatas y de anticuerpos (a saber, humoral) del sistema inmunitario del hospedador.

Las bacterias intracelulares facultativas también pueden pasar parte de su ciclo de vida aisladas dentro de las células del hospedador, donde pueden protegerse de los aspectos innato y humoral del sistema inmunitario del huésped y pueden ser susceptibles a las respuestas mediadas por la célula del sistema inmunitario del hospedador. Una respuesta inmunitaria mediada por células es una respuesta inmunitaria que estimula los linfocitos T efectores, que a su vez se pueden convertir en linfocitos T de memoria (efectores o centrales) . Una respuesta inmunitaria mediada por células es resultado de la presentación de los antígenos sobre la superficie de las células hospedadoras. Las células fagocíticas del sistema inmunitario del hospedador son capaces de engullir bacterias vivas, bacterias muertas o componentes de las bacterias en los lisosomas, que se maduran a fagolisosomas y degradan los antígenos proteicos a péptidos. Los péptidos de los antígenos contenidos dentro de los fagolisosomas de las células fagocíticas pueden presentarse sobre la superficie de estas células fagocíticas mediante las moléculas del CMH de clase II para el reconocimiento por los linfocitos T CD4+ y la activación de una respuesta de linfocitos T cooperadores. Los péptidos de los antígenos expresados en el citosol de cualquier célula en el cuerpo de un mamífero pueden presentarse en la superficie de esa célula mediante las moléculas del CMH de clase I para el reconocimiento por los linfocitos T CD8+ y la activación de una respuesta de linfocitos T citotóxicos (LTC) . No obstante, las bacterias intracelulares muertas o los componentes de las bacterias intracelulares pueden no invadir las células no fagocíticas o pueden no escapar del fagolisosoma de una célula fagocítica en el citosol, lo que da lugar a la activación y a la maduración de las células fagocíticas, por ejemplo, macrófagos y células dendríticas. Por lo tanto, los antígenos de las bacterias intracelulares muertas o los componentes de las bacterias intracelulares pueden no estar disponibles para la presentación directa con el CMH I y podrían no activar una respuesta de LTC. La capacidad de las bacterias intracelulares para producir proteínas dentro de los fagolisosomas y/o citosol del hospedador puede ser necesaria para desencadenar una respuesta inmunitaria celular completamente eficaz.

Recientemente se han desarrollado cepas de Listeria monocytogenes a modo de vehículos de suministro intracelular de proteínas heterólogas que permiten suministrar antígenos al sistema inmunitario para inducir una respuesta inmunitaria a condiciones clínicas que no permiten la inyección del agente que provoca la enfermedad, tal como el cáncer (patente de los EE.UU. n.º 6 051 237 de Paterson; patente internacional WO 99/29884; patente de los EE.UU. n.º 6 565 852) y el VIH (patente de los EE.UU. n.º 5 830 702 de Portnoy y Paterson) . Como bacteria intracelular facultativa, L. monocytogenes desencadena respuestas inmunitarias celulares y humorales específicas de antígenos bacterianos. Después de que la bacteria Listeria entre en una célula del organismo hospedador, la bacteria Listeria produce proteínas específicas de Listeria que le permiten escapar del fagolisosoma de la célula hospedadora engullidora y quedarse en el citosol de esa célula. En la célula, L. monocytogenes prolifera y expresa las proteínas necesarias para la supervivencia, pero también expresa los genes heterólogos unidos operativamente a los promotores de Listeria. La presentación de péptidos de estas proteínas heterólogas sobre la superficie de la célula engullidora junto a las proteínas del CMH permite la generación de una respuesta de linfocitos T. Dado que L. monocytogenes es un microorganismo patógeno grampositivo de animales y de humanos que se transmite por los alimentos y que es responsable de infecciones graves en los individuos inmunocomprometidos y en las mujeres embarazadas, las cepas de estas bacterias se deben atenuar de manera que se reduzca la toxicidad para el hospedador, al mismo tiempo que se mantiene la inmunogenia de la vacuna. Esta toxicidad se debe a la invasión bacteriana de diferentes órganos y tejidos del hospedador, tal como los de hígado, bazo y sistema nervioso central. Sería beneficioso reducir los riesgos asociados al uso de Listeria monocytogenes a modo de vacuna sin afectar su capacidad para inducir la inmunidad celular adaptativa que sea específica del antígeno heterólogo del que porte su código y que está relacionado con determinadas enfermedades malignas e infecciosas.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención definida por las reivindicaciones da a conocer de manera general la bacteria Listeria monocytogenes atenuada, en particular, así como métodos para utilizar las bacterias Listeria en vacunas. Las vacunas son útiles para inducir respuestas inmunitarias y para el tratamiento y/o prevención de un amplio abanico de enfermedades, que incluyen el cáncer.

En un aspecto, la descripción da a conocer un aislado bacteriano de Listeria que tiene atenuada la entrada en las células no fagocíticas (p. ej., contiene una internalina defectuosa, tal como la internalina B) y que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno que no es de Listeria. En algunas realizaciones, la bacteria tiene atenuada adicionalmente la diseminación de una célula a otra (p. ej., es defectuosa con respecto a ActA) . La bacteria Listeria atenuada pertenece a la especie Listeria monocytogenes. La bacteria Listeria atenuada es una cepa mutante de Listeria. También se da a conocer una composición inmunógena que comprende la bacteria Listeria, que es una vacuna que comprende la bacteria y un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o un adyuvante. Además, también se dan a conocer métodos para inducir en un hospedador una respuesta inmunitaria... [Seguir leyendo]

1. Bacteria Listeria monocytogenes atenuada que es una Listeria monocytogenes lactAlinlB, comprendiendo dicha bacteria adicionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno que no es de Listeria, estando dicha molécula de ácido nucleico unida operativamente a una secuencia reguladora capaz de expresar dicho antígeno.

2. Bacteria Listeria monocytogenes atenuada de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende al menos una mutación en uno o más genes seleccionados entre el grupo que consiste en lplA, plcA, plcB y mpl.

3. Bacteria Listeria monocytogenes atenuada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que el antígeno es un antígeno tumoral o procede de un antígeno tumoral.

4. Bacteria Listeria monocytogenes atenuada de acuerdo con la reivindicación 3, en la que el antígeno es un antígeno tumoral o procede de un antígeno tumoral seleccionado entre el grupo que consiste en mesotelina, sp17, PAGE-4, gp-100, PSMA, K-ras, TARP, proteinasa 3, WT-1, NY-ESO-1, CEA, Her-2 y SPAS-1.

5. Bacteria Listeria monocytogenes atenuada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el antígeno es un antígeno de enfermedad infecciosa o procede de un antígeno de enfermedad infecciosa.

6. Bacteria Listeria monocytogenes atenuada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la bacteria es defectuosa con respecto a una enzima de reparación del ADN y en donde el ácido nucleico de la bacteria se ha modificado al hacerlo reaccionar con un compuesto que actúa selectivamente sobre el ácido nucleico y que reacciona directamente con el ácido nucleico, de manera que la proliferación de la bacteria está atenuada, por lo que la bacteria tiene atenuada la diseminación de una célula a otra.

7. Bacteria Listeria monocytogenes atenuada de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el ácido nucleico de la bacteria se ha modificado al ponerlo en contacto con un psoraleno activado mediante irradiación UVA.

8. Composición inmunógena, que comprende la bacteria Listeria monocytogenes atenuada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

9. Vacuna, que comprende (a) la bacteria Listeria monocytogenes atenuada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable o un adyuvante.

10. Célula presentadora de antígeno profesional, que comprende la bacteria Listeria monocytogenes atenuada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

11. Bacteria Listeria monocytogenes atenuada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o composición inmunógena de acuerdo con la reivindicación 8, o una vacuna de acuerdo con la reivindicación 9, o una célula presentadora de antígeno profesional de acuerdo con la reivindicación 10, para uso en un método de inducción de una respuesta inmunitaria en un hospedador contra un antígeno que no es de Listeria.

12. Bacteria Listeria monocytogenes atenuada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o composición inmunógena de acuerdo con la reivindicación 8, o una vacuna de acuerdo con la reivindicación 9, o una célula presentadora de antígeno profesional de acuerdo con la reivindicación 10, para uso en un método de prevención o tratamiento de una enfermedad en un hospedador.

Figura 1A

Figura 1B

Figura 1C

Figura 2B

Figura 2C

Figura 5

Porcentaje de linfocit os T CD8+ IF N

, , , , , , , , , , , , , , Figura 10

Figura 11B