Interferón alfa 2b modificado con polietilenglicol y método de preparación y aplicaciones de este.

Interferón-α2b pegilado (IFN-α2b) de la estructura de debajo,

obtenido por unión de IFN-α2b con un polietilenglicol ramificado con forma de Y (YPEG):**Fórmula**

donde,

Pa y Pb son iguales o diferentes polietilenglicoles (PEG);

j es un número entero entre 1-12;

Ri es H, grupo alquilo Ci-C12 no sustituido o sustituido, arilo sustituido, aralquilo, o heteroalquileno; y

X1 y X2 son independientemente un grupo de unión, donde X1 es (CH2)n, y X2 se selecciona del grupo que consiste en (CH2)n, (CH2)nOCO, (CH2)nNHCO y (CH2)nCO, donde n es un número entero entre 1-10, donde el YPEG se une a IFN- αb vía un enlace amido formado por la cadena lateral del grupo ε-amino del residuo de Lys dentro de IFN-α2b correspondiente a la posición 134 en la SEC ID nº1.

Interferón alfa 2b modificado con polietilenglicol y método de preparación y aplicaciones de este Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a interferón-˞2b modificado con polietilenglicol ramificado con forma de Y (PEG) en un único residuo de aminoácido y su preparación, al igual que al uso del IFN-a2b pegilado preparado en un único residuo de aminoácido en el campo farmacéutico.

Antecedentes de la invención [0002] Interferones (IFN) son una familia de proteínas de molécula pequeña o glicoproteínas producidas por células eucariotas en respuesta a infección vírica y otros estímulos antigénicos, que muestran amplio espectro antivírico, efectos inmunomoduladores y antiproliferativos. Los IFN se han aplicado mucho en el tratamiento de varias condiciones y enfermedades, como infecciones víricas, por ejemplo, hepatitis B, hepatitis C y VIH; trastornos inflamatorios y enfermedades, por ejemplo, esclerosis múltiple, artritis, asma, fibrosis cística y enfermedad pulmonar intersticial; y tumores, por ejemplo, mielomas, linfomas, cáncer de hígado, cáncer pulmonar, leucemia de células pilosas, y etcétera, en (Kenji Oritani, Paul W Kincade, et al. Type I interferon and limitin: a comparison of structures, receptors, and functions.20 Cytokine and Growth Factor Reviews, 12, 337-348, 2001; Yu-Sen Wang, Stephen Youngster, et al. Structural and biological characterization of PEGylated recombinant interferon alpha-2b and its therapeutic implications. Advance Drug Deliver y Reviews, 54, 547-570, 2002) .

Los IFNa se clasifican en cuatro tipos según sus diferencias en propiedades químicas, inmunológicas y biológicas: interferón-a, º y E. El interferón-a (IFN-a) se segrega por leucocitos. IFNs-a humanos se codifican por una familia multigénica que consiste en aproximadamente 20 genes, las proteínas codificadas comparten aproximadamente 90% de homología de secuencia de aminoácido (Henco K., Brosius F.J., et al. J. Mol. Biol., 185, 227-260, 1985) . IFNa2b humano es uno de los subtipos a2 de la subfamilia de familia de IFN-a humano, y es una proteína de una cadena sencilla con varias actividades biológicas. La proteína de cadena sencilla consiste en 165 residuos de aminoácidos con 4 Cys, donde dos enlaces de disulfuro intracatenarios se forman entre Cys1-Cys98 y Cys29-Cys138 respectivamente y el aminoácido N-terminal es Cys con un libre grupo a-NH2. Los residuos en las posiciones 31, 49, 70, 83, 112, 121, 131, 133, 134 y 164 de la secuencia de aminoácidos son Lys, cada uno de los cuales contiene un libre grupo E-NH2. Esta proteína es glicosilada y sensible a muchas proteasas. La secuencia de aminoácidos de interferón- a2b humano se muestra en la SEC ID nº: 1.

Los IFN se administran normalmente parenteralmente en tratamientos clínicos. La vida media in vivo corta (2-4h) e inmunogenicidad fuerte de los IFN suponen un intervalo de dosificación más corto y una frecuencia de dosificación mayor. Como los anticuerpos generados significativamente reducen la eficacia terapéutica, es difícil conseguir eficacia ideal clínica. La tecnología de modificación de polietilenglicol (PEG) desarrollada en los últimos años ha proporcionado una solución posible a los problemas anteriores.

PEG es un polímero orgánico biodegradable, no tóxico e inerte y es importante en los campos de biotecnología y farmacéutica. La técnica de modificación de PEG es unir PEG a una proteína activa vía enlace covalente. Después de la glicosilación del polietileno (pegilación) , las propiedades de la proteína pueden mejorarse significativamente, por ejemplo, la prolongación de vida media metabólica del medicamento, la reducción de inmunogenicidad, el aumento de seguridad, la mejora de eficacia terapéutica, la reducción de frecuencia de dosificación, el aumento de solubilidad de solubilidad/agua del medicamento, el aumento de resistencia contra la proteólisis, la facilitación de liberación controlada del medicamento etcétera. Para más detalles consultar Inada et al. J. Bioact. and Compatible Polymers, 5, 343, 1990, Delgado et al. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9, 249, 1992, Katre. Advanced Drug Deliver y Systems, 10, 91, 1993 y U.S. Patent publication UP 4179337.

Se describe en la patente US n°4179337, después de unión de PEG a una enzima o insulina, la inmunogenicidad de la proteína se redujo, mientras simultáneamente las actividades de la proteína se redujeron también. Esto también se encontró en G-CSF (Satake-Ishikawa et al. Cell Structure and Function, 17, 157-160, 1992) , IL-2 (Katre et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1487, 1987) , TNF-a (Tsutsumi et al. Jpn. J. Cancer Res., 85, 9, 1994) , IL-6 (Inoue et al. J. Lab. Clin. Med., 124, 529, 1994) y CD4-IgG (Chamow et al. Bioconj. Chem., 5, 133, 1994) .

Se informó de que la proteína ramificada PEG-modificada mostraba mejor tolerancia de pH, termo-estabilidad y resistencia contra la proteólisis que proteínas PEG-modificadas de cadena lineal (Monfardini et al. Bioconjugate Chem., 6, 62, 1995) . Generalmente, una molécula de PEG modifica una proteína por conexión de esta al grupo a-amino N-terminal o grupos E-amino de un residuo de Lys en la molécula de proteína. Hay normalmente tres tipos de PEG para modificación de proteína: un PEG de cadena lineal (EP 0593868) , un PEG ramificado con forma de U (EP 0809996) y un PEG ramificado con forma de Y (CN1243779C) .

Habitualmente muchos tipos de proteínas pegiladas se han aplicado clínicamente. En 1990, la adenosinadesaminasa de bovino pegilada (Adagen) producido por ENZON Inc. fue aprobada por FDA y usada para tratar la enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave (pegfamg013102LB, http://www.fda.gov) . En 1994, otra proteína PEG-modificada para tratar leucemia aguda linfoblástica, la asparaginasa pegilada (pegaspargase, Oncaspar) , se comercializó también en EEUU (103411s50521b1, http://www.fda.gov) . El interferón-a2b modificado de PEG (PEG IFNa2b, PEG-intrón) desarrollado por Schering-Plough fue aprobado por FDA para comercialización en 2000 y el interferóna pegilado (PEG IFN-a2a, Pegasys) producido por Hoffman-la Roche Ltd. fue también aprobado para comercialización en 2002, ambos se usan para tratar hepatitis (103964s50371b1, pegsche011901LB, http://www.fda.gov) . En 2002, el factor de estimulación de colonia de granulocito humano modificado de PEG producido por Amgen Inc. (PEG-filgrastim, Neulasta) fue también aprobado por FDA, que se usa para tratar cáncer de mama metastásico (pegfamg013102LB, http://www.fda, gov) . La FDA también aceptó la solicitud para antagonista factor de crecimiento de humano pegilado desarrollado por Pharmacia. El PEG combinado con fragmento de anticuerpo de TNF-a de Celltech y el receptor de PEG-TNF de Amgen se evalúan en los ensayos clínicos avanzados. La primera molécula PEG-orgánica conjugada, camptotecina pegilada, también ha entrado en la fase II de la prueba clínica. En 2004, el PEG modificó oligonucleótido (Pegaptanib, Macugen™) fue aprobado por FDA. El metabolismo in vivo del PEG en el medicamento (o PEG mismo) ya se ha entendido claramente, y PEG ha demostrado ser un modificador de medicamento bueno y seguro sin ningún efecto adverso.

Los PEG que se pueden unir a un medicamento de proteína normalmente necesitan derivatización, de modo que uno o dos grupos terminales de los extremos de PEG pueden activarse químicamente para poseer un grupo funcional apropiado que muestra actividad, y así pueden formar un enlace covalente estable con, al menos, un grupo funcional del medicamento para ser unido. Por ejemplo, PEG se puede unir a E-NH2 del residuo de Lys en la cadena de péptido de proteína, o a a-NH2 del residuo de aminoácido N-terminal de la cadena peptídica de proteína. En la pegilación de IFN-a descrita en la patente europea EP0809996, PEG-NHS se une a través de sustitución nucleofílica a a-NH2 del aminoácido N-terminal o E-NH2 de Lys en IFN-a. El PEG-NHS mencionado en la patente anterior es un derivado de PEG ramificado con forma de U (PEG2-NHS) , la fórmula molecular de este es la siguiente:

donde, R y R' son independientemente un grupo alquilo de peso molecular bajo, n y n' son de 600 a 1500, y el peso molecular medio del PEG es de 26KD a 66KD. La fórmula molecular del PEG2-NHS-modificado-IFN-a es la siguiente:

Donde una o más moléculas PEG2-NHS se unen a a-NH2 del aminoácido N-terminal o E-NH2 de Lys en IFN-a, los productos obtenidos son una mezcla de IFN-a no pegilados, IFN-a pegilados en un único residuo de aminoácido y IFN-a pegilados en residuos de aminoácidos múltiples. El IFN-a pegilado en un único residuo... [Seguir leyendo]

1. Interferón-a2b pegilado (IFN-a2b) de la estructura de debajo, obtenido por unión de IFN-a2b con un polietilenglicol ramificado con forma de Y (YPEG) :

donde, Pa y Pb son iguales o diferentes polietilenglicoles (PEG) ;

j es un número entero entre 1-12; Ri es H, grupo alquilo Ci-C12 no sustituido o sustituido, arilo sustituido, aralquilo, o heteroalquileno; y X1 y X2 son independientemente un grupo de unión, donde X1 es (CH2) n, y X2 se selecciona del grupo que consiste en (CH2) n, (CH2) nOCO, (CH2) nNHCO y (CH2) nCO, donde n es un número entero entre 1-10, donde el YPEG se une a IFNab vía un enlace amido formado por la cadena lateral del grupo E-amino del residuo de Lys dentro de IFN-a2b

correspondiente a la posición 134 en la SEC ID nº1.

2. IFN-a2b pegilado según la reivindicación 1, con la estructura como sigue

donde R y R' son independientemente un grupo alquilo C1-C4, preferiblemente metilo; j es un número entero entre 1-12; m y m' indica el grado de polimerización y puede ser cualquier número entero; m+m' es preferiblemente de 600 a 1500, y el peso molecular medio total del YPEG es preferiblemente de aproximadamente 10000 a aproximadamente 60000 Dalton, de forma más preferida aproximadamente 40000 Dalton.

3. IFN-a2b pegilado según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el IFN-a2b se extrae de una fuente natural o se obtiene a través de biotecnología recombinante, es preferiblemente IFN-a2b humano con la secuencia de 30 aminoácidos como se muestra en la SEC ID nº1, de forma más preferida es un IFN-a2b humano recombinante.

4. IFN-a2b pegilado según la reivindicación 3, donde el IFN-a2b humano recombinante se sintetiza artificialmente o se expresa de un sistema de expresión seleccionado del grupo que consiste en un sistema de expresión procariota como E. coli, un sistema de expresión de levadura eucariota como Pichia, un sistema de expresión de célula de insecto o un 35 sistema de expresión de célula de mamífero como CHO.

5. IFN-a2b pegilado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el YPEG es un YPEG de brazos iguales de peso molecular de 40000 Dalton.

6. Composición comprendiendo una cantidad farmacéuticamente eficaz del IFN-a2b pegilado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un portador farmacéuticamente aceptable o excipiente.

7. Composición según la reivindicación 6, comprendiendo además manitol, un aminoácido, cloruro sódico y acetato sódico, donde el aminoácido es preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en ácido aspártico, asparagina y 45 glicina.

8. Uso del IFN-a2b pegilado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o de la composición según la reivindicación 6 o 7 en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad en necesidad de tratamiento con IFN-a2b, donde la enfermedad se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en infecciones víricas, por ejemplo, hepatitis B, 50 hepatitis C, hepatitis D y condiloma acuminado; tumores, por ejemplo, leucemia de células pilosas, leucemia mieloide crónica, leucemia maligna no Hodgkin de grado bajo, linfólisis mediada por célula sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, melanoma maligno, linfoma de células T cutáneas, papiloma laríngeo, carcinoma de célula renal metastásico o recurrente; trastornos inflamatorios y enfermedades, por ejemplo, esclerosis múltiple, artritis, asma, fibrosis cística y enfermedad pulmonar intersticial y trombocitemia relacionada con enfermedades mieloproliferativas.

9. Método para preparar y purificar el IFN-a2b pegilado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que incluye las etapas:

(a) en una condición alcalina, preferiblemente a pH 9, 0, permitir a PEG ramificado con forma de Y de la siguiente fórmula reaccionar con IFN-a2b y obtener IFN-a2b pegilado;

donde R y R' son independientemente un grupo alquilo C1-C4, preferiblemente metilo; j es un número entero entre 1-12; m y m' indica el grado de polimerización y puede ser cualquier número entero, y m+m' es preferiblemente de 600 a 1500;

(b) captura de los productos reactivos obtenidos en la etapa (a) con una resina de intercambio de aniones, preferiblemente Q sefarosa FF, y elución de los productos en un gradiente de aniones, preferiblemente en un gradiente de ión cloruro, para obtener productos modificados;

(c) elución de los productos reactivos capturados en la etapa (b) con una resina de intercambio de cationes, preferiblemente SP sefarosa FF, en un gradiente de cationes, preferiblemente en un gradiente de ión sodio, y luego recogida de cada pico separadamente;

(d) determinación de la actividad del producto de cada pico y selección del pico correspondiente al producto de 25 reacción con actividad máxima.

10. Método según la reivindicación 9, donde el YPEG tiene un peso molecular de 40KG, y es preferiblemente un Y-PEG

de brazos iguales, y más preferiblemente la proporción molar de reacción de IFN-a2b y YPEG es 1:2. 30