Hormona del crecimiento modificada con polietilenglicol bicatenario, método de preparación y aplicación de esta.

Metodo de preparacion de una hormona de crecimiento humana polietilenglicolada (pegilada) o una preparacion de hormona de crecimiento humana polietilenglicolada (pegilada),

que comprende:

(a) en una solucion con pH no inferior a 6.0, poner el polietilenglicol (PEG) bicatenario ramificado con forma de U o con forma de Y en contacto con la hormona de crecimiento humana;

(b) evaluar el producto modificado por el PEG bicatenario en un unico sitio obtenido en el paso a) en SDS-PAGE de concentracion apropiada, donde el producto muestra dos bandas;

(c) separar y recuperar el producto de peso molecular aparente inferior en las dos bandas modificado por el PEG bicatenario en un unico sitio,

donde el polietilenglicol bicatenario ramificado con forma de U presenta la siguiente formula (IV)**Fórmula**,

donde, R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular; n y n' indican el grado de polimerizacion y pueden ser cualquier numero entero; n+n' esta entre 600 y 1500; el peso molecular medio del PEG ramificado con forma de U es aproximadamente desde 26kD hasta 66kD, o

donde el polietilenglicol bicatenario ramificado con forma de Y presenta la siguiente formula (III):**Fórmula**

donde, R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular, m y m' indican el grado de polimerizacion y pueden ser cualquier numero entero, j es un numero entero de 1 a 12, y el peso molecular total medio del PEG ramificado con forma de Y es de aproximadamente 26kD a 60kD.

Hormona del crecimiento modificada con polietilenglicol bicatenario, método de preparación y aplicación de esta

Campo técnico [0001] La invención pertenece al campo de tecnología de preparación biológica, en particular a una hormona del crecimiento (GH) modificada con polietilenglicol bicatenario (PEG) con actividad biológica alta, y el método de preparación de esta, al igual que el uso de la hormona del crecimiento pegilada obtenida en el campo farmacéutico.

Estado de la técnica [0002] La hormona de crecimiento humana (HuGH) es una hormona de proteína segregada por la glándula pituitaria anterior humana, el precursor de la cual consiste en 217 residuos de aminoácidos, donde los primeros 26 residuos de aminoácidos componen un péptido señal, y los restantes 191 residuos de aminoácidos componen la molécula madura. Hay dos enlaces disulfuro intra-moleculares (Cys79 y Cys191; Cys208 y Cys215) , y la molécula no está glicosilada con un peso molecular de 22kD. La secuencia del HuGH se describe en SEC ID n.º: 1 (NCBI: P01241; AAA72260; Denoto F M, et al. Human growth hormone DNA sequence and mRNA structure: possible alternative splicing. Nucleic Acids Res., 9: 3719-3730, 1981; Roskam W, et al. Molecular cloning and nucleotide sequence of the human growth hormone structural gene. Nucleic Acids Res., 7: 305-320, 1979; Martial J A, et al. Human growth hormone: Complementar y DNA cloning and expression in bacteria. Science,

205: 602-607, 1979; Chen E Y, et al. The human growth hormone locus: nucleotide sequence, biology and evolution. Genomics, 4: 479-497, 1989) . Las funciones primarias del HuGH incluyen promover el crecimiento de una célula, órgano o hueso, y está íntimamente relacionado con el anabolismo del cuerpo (Iglesias P, et al. Recombinant human growth hormone therapy in malnourished dialysis patients: a randomized controlled study. Am. J. Kidney Dis., 32 (3) : 454-463, 1998; Neely E K, Use and abuse of human growth hormone. Annu. Rev. Med., 45:407-410, 1994) . Después de más de 20 años de aplicación clínica de la hormona de crecimiento humana recombinante (rHuGH) producida por tecnología del ADN recombinante, la eficacia clínica y seguridad del rHuGH han sido demostradas.

Los resultados de muchas investigaciones han indicado que, rHuGH muestra efectos terapéuticos significativos en el tratamiento del enanismo, quemaduras, heridas, fracturas de hueso, úlceras de sangrado, insuficiencia renal, SIDA, trastornos anabólicos, enanismo por deficiencia de hormona del crecimiento endógena, síndrome Turner y deficiencia de la hormona del crecimiento adulta, y también muestra efecto significativo en la terapia antienvejecimiento. Actualmente, rHuGH es el único medicamento eficaz para el tratamiento del enanismo. En marzo de 2001, las indicaciones que han sido aprobadas por FDA para introducir investigación clínica de rHuGH incluyen: tratamiento intensivo de retención de nitrógeno de quemaduras severas, síndrome de intestino corto (administrado solo o en combinación con glutamina) , detención del crecimiento relacionado con SIDA etc. Actualmente, las indicaciones de rHuGH que han sido aprobadas para el mercado incluyen: enanismo por deficiencia de la hormona del crecimiento endógena de adolescentes, enanismo relacionado con el síndrome Turner, enanismo por deficiencia de la hormona del crecimiento de órgano o espontáneo de adolescentes, síndrome Prader-Willi, trastorno del crecimiento prematuro, trastorno catabólico relacionado con SIDA, insuficiencia renal crónica relacionada con retraso del crecimiento y deficiencia de la hormona del crecimiento adulta etc.

El polietilenglicol es un polímero orgánico inerte, biodegradable y no tóxico, y es importante en los campos tanto de la biotecnología como de la farmacéutica. La técnica de la modificación con PEG es conectar PEG a una proteína activa a través de un enlace covalente. Después de la polietilenglicolación (PEGilación) , las propiedades de la proteína pueden mejorar significativamente, por ejemplo la prolongación de la vida media metabólica del medicamento, la reducción de inmunogenicidad, el aumento de seguridad, la mejora de eficacia terapéutica, la reducción de la frecuencia de dosificación, el aumento de la solubilidad de medicamento/solubilidad de agua, el aumento de resistencia contra la proteólisis, la facilitación de la liberación controlada del medicamento etcétera (Inada et al. J. Bioact. and Compatible Polymers, 5, 343, 1990; Delgado, et al. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9, 249, 1992; Katre, Advanced Drug Deliver y Systems, 10, 91, 1993 and Davis et al. U.S. Patent N.º 4179337) . Se describe en la patente EE. UU. n.º 4179337 que después de enlazar PEG a una proteína tal como una enzima o insulina, la inmunogenicidad de la proteína se redujo, mientras que simultáneamente las actividades de la proteína se redujeron también, pero al mismo tiempo la proteína modificada retuvo una proporción determinada de las actividades de la proteína no modificada original. Tal efecto fue también encontrado en G-CSF (Satake-Ishikawa et al. Cell Structure and Function, 17, 157-160, 1992) , IL-2 (Katre et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1487, 1987) , TNF-α (Tsutsumi et al. Jpn. J. Cancer Res., 85, 9, 1994) , IL-6 (Inoue et al. J. Lab. Clin. Med., 124, 529, 1994) y CD4-IgG (Chamow et al. Bioconj. Chem., 5, 133, 1994) .

Se describe en la patente EE. UU. n.º 5824784 que un modificador PEG con un grupo aldehído al final fue usado para obtener un PEG-G-CSF que fue modificado por un único PEG en un sitio fijo (aminoácido N-terminal de la proteína) . El modificador PEG- NHS sintetizado por activación con N-hidroxisuccinimida (NHS) puede formar un enlace amida con grupo el ε-amino de lisina en G-CSF. PEG-NHS tiene una alta actividad química pero selectividad pobre, y así es difícil obtener un producto modificado por un único PEG en un sitio fijo. En comparación con un producto modificado multi-PEG, el producto modificado mono-PEG es más homogéneo y es así beneficioso para la separación y purificación, que por lo tanto facilita el control de la calidad y asegura estabilidad entre lotes en la producción a gran escala.

Actualmente algunos tipos de fármacos de proteína terapéutica pegilada, tal como adenosina deaminasa pegilada (Adagen.RTM, Enzon Pharmaceuticals) , L-asparaginasa pegilada (Oncapspar.RTM, Enzon Pharmaceuticals) , interferón-α2b pegilado (PEG-Intron.RTM, Schering-Plough) e interferón-α2a pegilado (Pegasys, Roche) , factor estimulante de colonias de granulocitos pegilado (Neulasta.RTM, Amgen) , han sido aplicados clínicamente. El metabolismo in vivo de la fracción de PEG en un medicamento (o PEG en sí mismo) ha sido ya claramente entendido, y se ha probado que el PEG es un buen y seguro modificador de medicamento sin ningún efecto adverso.

El PEG que se puede enlazar a un medicamento de proteína normalmente necesita ser derivatizado, de modo que uno o dos grupos terminales en los extremos de PEG pueden ser químicamente activados para poseer un grupo funcional apropiado que muestre actividad para, y así pueda formar un enlace covalente estable con, al menos un grupo funcional del medicamento al que se debe enlazar. Por ejemplo, PEG se puede enlazar al ε-NH2 de un residuo de Lys en la cadena peptídica de proteína, o al α-NH2 del residuo de aminoácido N-terminal de la cadena peptídica de proteína. Hay normalmente tres formas de politilenglicoles que han sido usadas para modificar una proteína: una molécula de cadena lineal (EP 0593868; Yu-Sen Wang et al. Advanced Drug Deliver y Reviews, 54: 547-570, 2002; Yu-Sen Wang et al. Biochemistr y , 39, 10634-10640, 2000.) , una molécula ramificada en forma de U (EP 0809996) y una molécula ramificada en forma de Y (CN1243779C, EP1496076) . La Patente Europea n.º EP0809996 describe la PEGilación de IFN-α.

Se cree generalmente en la técnica que, después de la modificación con PEG, las propiedades de la mayoría de proteínas sufrirán los siguientes cambios: 1. la inmunogenicidad y antigenicidad se reducen; 2. la vida media cíclica se prolonga; 3. la solubilidad aumenta; 4. la proteína es tolerante a proteolisis; 5. la disponibilidad biológica aumenta; 6. la toxicidad disminuye; 7. la termoestabilidad y estabilidad mecánica aumenta; 8. el punto isoeléctrico, el comportamiento electroforético, y propiedades dinámicas cambian, etc. Además, uno de los puntos más importantes es que la modificación con PEG tendrá como resultado la reducción de las actividades celulares de una proteína, que es principalmente debido a los grupos que han sido introducidos en el producto final, incluyendo PEG y los enlaces entre PEG y la proteína que debe ser modificada, y también... [Seguir leyendo]

1. Método de preparación de una hormona de crecimiento humana polietilenglicolada (pegilada) o una preparación de hormona de crecimiento humana polietilenglicolada (pegilada) , que comprende:

(a) en una solución con pH no inferior a 6.0, poner el polietilenglicol (PEG) bicatenario ramificado con forma de U o con forma de Y en contacto con la hormona de crecimiento humana;

(b) evaluar el producto modificado por el PEG bicatenario en un único sitio obtenido en el paso a) en SDS-PAGE de concentración apropiada, donde el producto muestra dos bandas;

(c) separar y recuperar el producto de peso molecular aparente inferior en las dos bandas modificado por el PEG bicatenario en un único sitio, donde el polietilenglicol bicatenario ramificado con forma de U presenta la siguiente fórmula (IV) ,

donde, R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular; n y n' indican el grado de polimerización y pueden ser cualquier número entero; n+n' está entre 600 y 1500; el peso molecular medio del PEG ramificado con forma de U es aproximadamente desde 26kD hasta 66kD, o donde el polietilenglicol bicatenario ramificado con forma de Y presenta la siguiente fórmula (III) :

donde, R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular, m y m' indican el grado de polimerización y pueden ser cualquier número entero, j es un número entero de 1 a 12, y el peso molecular total medio del PEG ramificado con forma de Y es de aproximadamente 26kD a 60kD.

2. Método según la reivindicación 1, donde el pH de (a) no es inferior a 7, 0.

3. Método según la reivindicación 1, donde el pH de (a) no es inferior a 8, 0.

4. Método según la reivindicación 1, donde el pH de (a) no es inferior a 9, 0.

5. Método según la reivindicación 1, donde el pH de (a) es 10, 5.

6. Método según la reivindicación 1, donde la proporción molar de la hormona del crecimiento respecto al PEG bicatenario es aproximadamente 1: 2.

7. Método según la reivindicación 1, donde el SDS-PAGE en (b) es 12% SDS-PAGE.

8. Método según la reivindicación 1, que comprende además purificar el producto recuperado.

9. Método según la reivindicación 8, donde la purificación del producto se realiza usando cromatografía de gel.

10. Método según la reivindicación 9, donde la cromatografía de gel comprende Cromatografía Q Sepharose FF, cromatografía DEAE Sepharose FF y cromatografía MacroCap SP.

11. Método según la reivindicación 1, este método es para preparar una preparación de hormona de crecimiento humana pegilada, en dicho método en el paso (a) una solución se usa con un pH no inferior a 8, 0, y donde el producto recuperado en el paso (c) es una mezcla predominantemente que contiene el producto de peso molecular aparente inferior modificado por el PEG bicatenario en un único sitio, donde el contenido del producto de peso molecular aparente inferior modificado por el PEG bicatenario en un único sitio no es inferior al 70%.

12. Método según la reivindicación 11, donde el pH no es inferior a 9, 0.

13. Método según la reivindicación 11, donde el pH es 10, 5.

14. Método según la reivindicación 11, donde el contenido del producto de peso molecular aparente inferior modificado por el PEG bicatenario en un único sitio no es inferior al 80 %.

15. Método según la reivindicación 11, donde el contenido del producto de peso molecular aparente inferior modificado por el PEG bicatenario en un único sitio no es inferior al 90 %.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, donde R y R' independientemente son alquilo C1 -C4.

17. Método según la reivindicación 16, donde R y R' independientemente son metilo.

18. Método según la reivindicación 1, donde m+m' está entre 600 y 1500.

19. Método según la reivindicación 18, donde m+m' es 910.

20. Método según la reivindicación 1, donde el peso molecular total medio del polietilenglicol bicatenario ramificado con forma de Y es 40kD.

21. Método según la reivindicación 1 o 20, donde el polietilenglicol bicatenario ramificado con forma de Y es de brazos iguales.

22. Método según la reivindicación 1, donde n+n' es 910.

23. Método según la reivindicación 1, donde el peso molecular medio del polietilenglicol bicatenario ramificado con forma de U es aproximadamente 40 kD.

24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1, 22 o 23, donde el polietilenglicol bicatenario ramificado con forma de U es de brazos iguales.

25. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1, 20 o 21, que comprende los pasos siguientes:

(a) en una solución con pH 9, 0 o 10, 5, poner un PEG bicatenario de la siguiente fórmula (III) en contacto con la hormona de crecimiento humana, donde la proporción molar de la hormona del crecimiento respecto al PEG bicatenario es aproximadamente 1: 2.

donde m+m' es 910, el peso molecular total medio del PEG bicatenario es aproximadamente 40kD;

(b) evaluar el producto modificado por el PEG bicatenario en un único sitio obtenido en el paso a) en 12% SDS- PAGE, donde el producto es principalmente una banda de peso molecular aparente inferior;

(c) separar y recuperar el producto de peso molecular aparente inferior modificado por el PEG bicatenario en un único sitio utilizando cromatografía de gel seleccionada de Cromatografía Q Sepharose FF, cromatografía DEAE Sepharose FF o cromatografía MacroCap SP.

26. Hormona de crecimiento humana pegilada de peso molecular aparente inferior o preparación de hormona de crecimiento

humana pegilada de peso molecular aparente inferior obtenida por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-25, donde la hormona del crecimiento es extraída de una fuente natural u obtenida por biotecnología recombinante.

27. Hormona de crecimiento humana pegilada según la reivindicación 26, donde la hormona de crecimiento humana tiene la secuencia de SEC ID n.º:1.

28. Hormona del crecimiento humana pegilada según la reivindicación 26, que tiene un peso molecular 62kD, como se muestra en la siguiente fórmula (VII) :

donde R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular; m+m' es 910; j es un número entero de 1 a 12.

29. Hormona de crecimiento humana pegilada según la reivindicación 28, donde R y R' son alquilo C1 -C4.

30. Hormona de crecimiento humana pegilada según la reivindicación 28, donde R y R' son metilo.

31. Hormona de crecimiento humana pegilada o preparación de hormona de crecimiento humana pegilada de cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30, donde la hormona de crecimiento humana recombinante es artificialmente sintetizada o expresada por un sistema de expresión seleccionado del grupo que consiste en: un sistema procariótico tal como E. coli.; un sistema eucariota tal como Pichia; un sistema celular de insecto; y un sistema celular mamífero tal como célula CHO.

32. Composición que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de la hormona de crecimiento humana pegilada o la preparación de hormona de crecimiento humana pegilada de cualquiera de las reivindicacione.

2. 31, y un portador farmacéuticamente aceptable o excipiente.

33. Composición según la reivindicación 32, que comprende manitol, un aminoácido, cloruro sódico, ácido acético y acetato sódico.

34. Composición según la reivindicación 33, donde el aminoácido es seleccionado del grupo que consiste en aspartato, asparagina, lisina y glicina.

35. Hormona de crecimiento humana pegilada o preparación de hormona de crecimiento humana pegilada de cualquiera de las reivindicacione.

2. 31 o composición de cualquiera de las reivindicacione.

3. 34 para uso como un medicamento.

36. Hormona de crecimiento humana pegilada o preparación de hormona de crecimiento humana pegilada de cualquiera de las reivindicacione.

2. 31 o composición de cualquiera de las reivindicacione.

3. 34, para uso en el tratamiento de una enfermedad que necesita tratamiento de hormona del crecimiento o para tratamiento antienvejecimiento.

37. Hormona de crecimiento humana pegilada o preparación de hormona de crecimiento humana pegilada de cualquiera de las reivindicacione.

2. 31 o composición de cualquiera de las reivindicacione.

3. 34 para uso en el tratamiento de una enfermedad que necesita tratamiento con hormona del crecimiento o para tratamiento antienvejecimiento, donde la enfermedad que necesita tratamiento con hormona del crecimiento se selecciona del grupo que consiste en enanismo, quemaduras, heridas, fracturas de hueso, úlceras de sangrado, insuficiencia renal, SIDA, enanismo por deficiencia de hormona del crecimiento endógena, síndrome Turner, trastorno anabólico y deficiencia de hormona del crecimiento adulta.