Eritropoyetina modificada.

Una pluralidad de moléculas de eritropoyetina (E PO), seleccionadas del grupo que consiste en EPO natural y rhuEPO,

conjugada cada una con al menos una molécula de polietilenglicol (PEG), estando dicha conjugación de forma predominante en el grupo a-ami no del extremo N-terminal, por medio de un enlace carbamato, con preferencia a estar en los residuos lisinilo de dicha proteína.

Eritropoyetina modificada 1. Campo de la Invención La presente invención se refiere a conjugados de protelna novedosos, en particular, a protelnas pegiladas novedosas, y a sus procedimientos de fabricación y de uso. Un aspecto de la presente invención se refiere a eritropoyetina pegilada que tiene una mayor eficacia cllnica y estabilidad durante el envio y el almacenamiento que las formulaciones de eritropoyetina actuales.

2. Antecedentes En los últimos años, se han usado pollmeros solubles en agua no antigénicos, tales como polietilenglicol ("PEG") , para la modificación covalente de polipéptidos de importancia terapéutica y de diagnóstico. El PEG es un pollmero que es no tóxico, no inmunógeno, altamente soluble en agua, y se elimina fácilmente del organismo. El PEG tiene muchas aplicaciones y se usa comúnmente en alimentos, cosméticos, bebidas y medicinas de venta con receta. Los PEG de calidad farmacéutica están aprobados para su uso en los Estados Unidos por la FDA y se usan ampliamente como vehlculos biofarmacéuticos, dado su alto grado de biocompatibilidad. La PEGilación puede modificar ciertas caracterfsticas de los productos biofarmacéuticos sin alterar su función, potenciando de este modo el efecto terapéutico.

En general, las moléculas de polietilenglicol se conectan a la proteína por medio de un grupo reactivo que se encuentra en la proteina. Los grupos amino, tales como los que están en los residuos de lisina o en el extremo N-terminal, son convenientes para dicha unión. El PEG se puede acoplar a productos biofarmacéuticos activos a través de los grupos hidroxilo en los extremos de la cadena usando una variedad de procedimientos qulmicos. Por ejemplo, se ha informado de que la unión covalente de PEG a polipéptidos terapéuticos tales como interleucinas (Knauf, M. J. et al., J, Biol. Chem. 1988, 263, 15, 064; Tsutsumi, Y. et al., J. Controlled Release 1995, 33, 447) , Interferones (Kita, Y. et al., Drug Des. Deliver y 1990, 6, 157) , catalasa (Abuchowski, A. et al., J. Blol. Chem. 1977, 252, 3, 582) , superóxido dismutasa (Beauchamp, C. O. et al., Anal. Biochem. 1983, 131, 25) Yadenosina desaminasa (Chen, R. et al., Biochim. Biophy. Acta 1981, 660, 293) , prolonga su semivida in vivo y/o reduce su inmunogenicidad y antlgenlcldad.

Las moléculas de PEG se han unido a través de grupos amino sobre los polipéptidos usando PEG metoxilado PEG ("mPEG") que tiene diferentes restos reactivos. Dichos polímeros incluyen mPEG-succinato de succinimidilo, mPEG-carbonato de succinimidilo, mPEG-imidato, y mPEG-cloruro cianúrico. De forma altemativa, se ha realizado la pegilación especifica de sitio en el extremo N-terminal, cadena lateral y extremo C-terminal de un potente análogo del factor liberador de la hormona del crecimiento, a través de sintesis en fase sólida (Felix, A. M. et al., Int. J. Peptide Protein Res. 1995, 46, 253) . También se ha realizado la pegilación especifica de sitio en el extremo N-terminal usando PEG activado con aldehido; sin embargo, dichas reacciones requieren tiempos de reacción largos y dichas reacciones requieren tiempos de reacción largos y son fuertemente dependientes del pH. Por ejemplo, la reacción requiere de 18 a 36 horas y, en general, es especifica sólo a pH ácido, volviéndose aleatoria a pH neutro o mayor pH (véase, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. N.O: 6.077.939 y 5.985.265. Esto limita los péptidos disponibles a los que pueden soportar condiciones ácidas prolongadas.

Un procedimiento adicional usado implicaba unir un péptido a extremidades de cadenas de PEG injertadas en la superficie Iiposomal de manera especifica de sitio a través de un grupo aldehldo reactivo en el extremo N-terminal generado por la oxidación de per y odato de sodio de la treonina N-terminal (Zalipsky, S. et al., Bioconj. Chem. 1995, 6, 705) . Sin embargo, este procedimiento se limita a polipéptidos con residuos de serina o treonina N-terminales.

También se han descrito procedimientos ayudados con enzimas para introducir grupos activados especificamente en el extremo C-terminal de un polipéptido (Schwarz, A. et al., Methods Enzymol. 1990, 184, 160; Rose, K. et al., Bioconjugate Chem. 1991, 2, 154; Gaertner, H. F. et al., J. Biol. Chem. 1994, 269, 7224) . Tipicamente, estos grupos activos pueden ser hidracida, aldehido y grupos amino aromáticos para la unión posterior de sondas funcionales a polipéptidos.

La mutagénesis especifica de sitio es otro enfoque que se ha usado para preparar polipéptidos para la unión a polímero especifica de sitio. El documento WO 90/12874 describe la pegilación dirigida a sitio de proteinas modificadas por la inserción de residuos de cisteina o la sustitución de otros residuos por residuos de cisteina. Esta publicación también describe la preparación de mPEG-eritropoyetina ("mPEG-EPO") haciendo reaccionar un derivado de mPEG especifico de cisteina con un residuo de cisteina introducido de forma recombinante sobre la EPO. De forma similar, se pegiló la interleucina 2 en su sitio de glucosilación después de la mutagénesis dirigida a sitio (Goodson, R. J. et al., Bio/Technology 1990, 8, 343) .

Las glucoproteinas proporcionan carbohidratos como sitios diana adicionales para la modificación. Se ha modificado la enzima peroxidasa con PEG-diamina a través de su resto carbohidrato (Urrutiogoity, M. et al., Biocatalysls 1989, 2, 145) . El documento WO 94/28024 describe los procedimientos para preparar mPEG-EPO a través de carbohidrato oxidado con per y odato. La qulmica implicada fue la formación de hidrazona haciendo reaccionar mPEG-hidracida con grupos aldehído del resto carbohidrato sobre la EPO. Este tipo de modificación genera grupos aldehldo reactivos a través de una etapa de oxidación, que puede oxidar potencialmente varios tipos de residuos de azúcar en el resto carbohidrato y algunos residuos aminoacídicos en el polipéptido, tales como metionina.

Eritropoyetina Una protelna ejemplar que demuestra la necesidad de mejora de los procedimientos de pegilaclón es la eritropoyetina. La eritropoyesis es la producción glóbulos rojos, que se produce para compensar la destrucción celular. La eritropoyesis es un mecanismo fisiológico controlado que permite que estén disponibles suficientes glóbulos rojos para una oxigenación tisular apropiada. La eritropoyetina humana natural (hEPO) es un pollpéptido producido en el riMn y es el factor plasmático humoral que estimula la producción de glóbulos rojos (Camot, P y Oeflandre, C (1906) C.R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev, A J (1953 Blood 8: 349; Reissmann, K R (1950) Blood 5: 372; Jacobson, L O, Goldwasser, E, Freid, W y Plzak, L F (1957) Nature 179: 6331-4) . La EPO natural estimula la división y diferenciación de los progenitores eritroides comprometidos en la médula ósea y ejerce su actividad biológica por la unión a receptores sobre precursores eritroides (Krantz, B S (1991) Blood 77: 419) .

La eritropoyetina se ha fabricado biosintéticamente usando tecnologia de AON recombinante (Egrie, J C, Strickland, 1 W, Lane, Jet al. (1986) Immunobiol. 72: 213-224) y es el producto de un gen de EPO humana clonado insertado en y expresado en las células de tejido de ovario de hámster chino (células CHO) . La estructura primaria de la forma predominante, totalmente grocesada, de hEPO se ilustra en SEa ID NO:1. Existen dos puentes disulfuro entre Cys7_Cys161 y Cys29 -Cys . El peso molecular de la cadena polipeptidica de EPO sin restos de azúcar es de 18, 236 Da. En la molécula de EPO intacta (peso molecular de aproximadamente 33 kO) , aproximadamente un 40 % del peso molecular está representado por los grupos de carbohidrato que glucosilan la protelna en los sitios de glucosilación sobre la protelna (Sasaki, H, Bothner, B, Den, A y Fukuda, M (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059) .

Debido a que la eritropoyetina humana es esencial en la formación de glóbulos rojos, la hormona es útil en el tratamiento de trastornos sangulneos caracterizados por una producción de glóbulos rojos baja o defectuosa y otras enfermedades para las que la expansión de la producción de glóbulos rojos seria beneficiosa para el paciente. Por ejemplo, la EPO se ha usado en el tratamiento de anemia en pacientes con insuficiencia renal crónica (CRF) (Eschbach, J W, Egri, J C, Oowning, M R et al. (1987) NEJM 316: 73-78; Eschbach, J W, Abdulhadi, M H, Browne, J K et al. (1989) Ann. Intem. Med. 111: 992; Egrie, J C, Eschbach, J W, McGuire, l, Adamson, J W (1988) Kidney Intl. 33: 262; Lim, V S, Oegowin, R L, Zavala, O et al. (1989) Ann. Intem. Med. 110: 108-114) yen pacientes con sida y cáncer que se están sometiendo a quimioterapia (Oanna, R P, Rudnick, S A, Abels, R Iln: M B, Gamick, ed. Er y thropoietin in Clinical Applications-An Intemational Perspective. New York, N.Y.: Marcel Oekker; 1990:... [Seguir leyendo]

1. Una pluralidad de moléculas de eritropoyetina (E PO) , seleccionadas del grupo que consiste en EPO natural y rhuEPO, conjugada cada una con al menos una molécula de polietilenglicol (PEG) , estando dicha conjugación de forma predominante en el grupo a-ami no del extremo N-terminal, por medio de un enlace carbamato, con preferencia a estar en los residuos lisinilo de dicha proteína.

2. La pluralidad de moléculas conjugadas de la reivindicación 1, en la que dicha proteína EPO está unida covalentemente a una o dos moléculas de PEG.

3. La pluralidad de moléculas conjugadas de la reivindicación 1, en la que dicho polietilenglicol (PEG) es Se-PEGo

4. Una composición farmacéutica que comprende: (a) una pluralidad de moléculas de EPO, seleccionadas del grupo que consiste en EPO natural y rhuEPO, conjugada cada una con al menos una molécula de polietilenglicol (PEG) , estando dicha conjugación de forma predominante en el grupo a-amino del extremo N-terminal, por medio de un enlace carbamato, con preferencia a estar en los residuos lisinilo de dicha proteína, y (b) un vehículo farmacéutica mente aceptable.

5. La composición de la reivindicación 4, en la que dicha proteína EPO está unida covalentemente a una o dos moléculas de PEG.

6. La composición de la reivindicación 4, en la que el polietilenglicol es Se-PEGo

7. La composición de la reivindicación 4, en la que la molécula de polietilenglicol tiene un peso molecular de aproximadamente 10 kD a aproximadamente 40 kD yes lineal o bien ramificado.

8. La composición de la reivindicación 4, en la que dicho vehículo farmacéuticamente aceptable está libre de proteína.

9. Un procedimiento de conjugación de forma covalente de polieülenglicol (PEG) soluble en agua, activado, con un residuo amlno de una proteína EPO que comprende: (a) hacer reaccionar dicha protelna con dicho PEG soluble en agua activado en un tampón de reacción que comprende DMSO de aproximadamente un 10 a aproximadamente un 40 por ciento (v/v) , y (b) retirar sustancialmente todo el PEG soluble en agua no conjugado.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el tampón de reacción es un tampón estándar libre de amina que comprende DMSO.

11. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicho PEG soluble en agua activado es Se-PEGo

12. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicho tampón de reacción tiene un pH de aproximadamente 6, 5 a aproximadamente 8, 5.

13. El uso de una cantidad terapéutica mente eficaz de una composición que comprende (a) una pluralidad de moléculas de EPO, seleccionadas del grupo que consiste en EPO natural y rhuEPO, conjugada cada una con al menos una molécula de polietilenglicol (PEG) , estando dicha conjugación de forma predominante en el grupo a-amino del extremo N-terminal, por medio de un enlace carbamato, con preferencia a estar en los residuos lisinllo de dicha protelna, y (b) un vehlculo farmacéutica mente aceptable, para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una Insuficiencia de glóbulos rojos en un paciente que lo necesita.

14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicha protelna EPO está unida covalentemente a una o dos moléculas de PEG.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho vehlculo farmacéuticamente aceptable está libre de protelna.

16. La composición de la reivindicación 1 o 4, en la que dichas moléculas de EPO están conjugadas con moléculas

de PEG de forma predominante en el extremo N-terminal, con preferencia a estar conjugadas en el residuo Iisina-52, lisina-116 o Iisina-154.

17. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende (a) una pluralidad de moléculas de EPO, seleccionadas del grupo que consiste en EPO natural y rhuEPO, conjugada cada una con al menos una molécula de poIietilenglicol (PEG) , estando dicha conjugación de forma predominante en el grupo a-amino del extremo N-terminal, por medio de un enlace carbamato, con preferencia a estar conjugada en los residuos lislnilo de dicha proteína, y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable, para su uso en un procedimiento para el tratamiento de una insuficiencia de glóbulos rojos en un paciente que lo necesita.