Un derivado peptidomimético de eritropoyetina y su sal farmacéutica, la preparación y usos del mismo.

Un derivado peptidomimético de eritropoyetina (EPO) de fórmula general (I) y sus sales farmacéuticamente aceptables,

R1-R2-(CH2)n1-R3-(CH2)n2-R4-R5 (I)

en la que R1, R5 se seleccionan entre péptidos cíclicos que tiene las siguientes secuencias:**Fórmula**

en las que n1, n2 son números enteros seleccionados independientemente entre de 0 a 10;

en las que R2, R4 se seleccionan entre -CO o -CH2;

en las que R3 se selecciona entre NCO(CH2)n4NHR6, CHOCONH(CH2)n5NHR6, o CHSCON(CH2)n5NHR6;

en las que n4 es un número entero seleccionado entre de 2 a 10,

en las que n5 es un número entero seleccionado entre de 2 a 10,

y en las que R6 se selecciona entre H o derivados de metoxi-polietilenglicol.

Un derivado peptidomimético de eritropoyetina y su sal farmacéutica, la preparación y usos del mismo.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un derivado peptidomimético de eritropoyetina (EPO) y sus sales farmacéuticas que se unen al receptor de EPO y activan el receptor de EPO o tienen el efecto agonista de EPO. Específicamente, la presente invención se refiere a un derivado peptidomimético de EPO, derivados para uso en un método de tratamiento de trastornos caracterizados por bajo nivel de EPO o población insuficiente o defectuosa de glóbulos rojos, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La EPO es una hormona glucoproteína con un peso molecular de aproximadamente 34 kD. La EPO en el plasma está compuesta por 165 aminoácidos con alto grado de glucosilación, en los que el componente principal de glucosilo es ácido siálico. En base al contenido de carbohidratos, la EPO de origen natural se divide en dos tipos, concretamente tipo α y β, en los que el tipo α contiene el 34% de carbohidrato y el tipo β contiene el 26% de carbohidrato. Estos dos tipos tienen las mismas características biológicas, antigenicidad y efecto clínico. El gen de EPO humana está ubicado en el área 22 del brazo largo del cromosoma 7. Su ADNc se clonó con éxito en 1985, y EPO humana recombinante (rHuEPO) se ha estado produciendo en gran medida usando tecnología recombinante génica y se ha usado ampliamente en clínica. La EPO se ha biosintetizado usando tecnología de ADN recombinante (Egrie, JC, Strickland, TW, Lane, J etc. (986) Immunobiology (Immunobiol) 72: 213-224) , que es el producto del gen de EPO humana clonada en células de ovario de hámster chino (células CHO) y expresada en su interior. La EPO humana de origen natural se traduce en primer lugar en cadenas polipeptídicas que contienen 166 aminoácidos con la posición 166 siendo arginina. En las modificaciones postraduccionales la arginina en la posición 166 se degrada usando hidroxilo peptidasa. El peso molecular de EPO humana sin glucosilo es 18236Da. En la molécula de EPO intacta, el glucosilo supone aproximadamente el 40% del peso molecular total (J. Biol. Chem. 262: 12059) .

La EPO es la primera citoquina aplicada en clínica y con mucho la preparación que incrementa la hemoglobina mejor conocida con un efecto sencillo y seguro. Tiene cierto efecto para anemia renal, anemia aplásica, mieloma múltiple, y hematuria paroxística nocturna; además, la aplicación de EPO puede reducir la cantidad de transfusión de sangre en la cirugía y en cierta medida curar la anemia causada por un tumor maligno, quimioterapia y artritis reumatoide. Dado que la EPO es generada principalmente por células endoteliales tubulares renales, la anemia causada por nefropatía es la primera indicación de EPO; la eficacia curativa de EPO sobre la anemia renal es casi del 100%, pero lo EPO no mejora la función renal. El tratamiento con EPO es seguro, eficaz y adecuado para tratar a largo plazo; Además, aborda el problema de escasez de suministro de sangre. En los mercados de fármacos biotecnológicos globales en 2006, los fármacos recombinantes de EPO supusieron 11, 9 mil millones de dólares estadounidenses. Existe un enorme volumen de mercado.

Ya en 1989, la EPO humana recombinante (EPOGEN) fue aprobada por la FDA estadounidense para el tratamiento de anemia renal, pero es solamente desde 1992 que EPOGEN entró en el mercado chino. La morbilidad anual de nefritis crónica es de aproximadamente el 0, 25% en China, de la cual una proporción considerable de pacientes desarrollará eventualmente insuficiencia renal. El número de pacientes con anemia renal es de aproximadamente 500-600 mil cada año. Además estimaciones conservadoras de consumo junto con el consumo en otra anemia relacionada con cáncer, el volumen de mercado doméstico es de aproximadamente 1, 2-1, 6 mil millones o aún más (calculado con el precio actual siendo 30-40 yuanes chinos/dosis, siendo el peso promedio de los pacientes 50 kg) . A partir de finales de los 1990, la EPO se ha clasificado como el fármaco de mejores ventas en las principales ciudades de China. La cantidad de consumo es de 62, 13 millones de yuanes en hospitales de muestra de las principales ciudades en toda China en 2003, con una clasificación de NO.56. El gasto en EPO en hospitales de muestra de las principales ciudades en toda China se incrementó hasta 80, 49 millones de yuanes chinos en 2004, con un incremento de año a año del 30%.

Como una hormona endógena que actúa sobre las células hematopoyéticas de la médula para promover proliferación, diferenciación y maduración definitiva de células progenitoras eritroides, la EPO desempeña un importante papel en la regulación del estado de oxigenación del cuerpo. En la fase embrionaria temprana, la EPO es generada por el hígado y a continuación se desplaza gradualmente al riñón. La EPO es secretada principalmente por células intersticiales tubulares renales después del nacimiento.

Durante la inducción de diferenciación de progenitores de glóbulos rojos por EPO, se induce la globulina, lo que permite a las células reclutar más hemoglobina con función de síntesis de hierro, que puede combinarse con el oxígeno en glóbulos rojos maduros; por lo tanto, los glóbulos rojos y la hemoglobina desempeñan un importante papel en el suministro de oxígeno al cuerpo. Este ciclo es causado por la interacción entre EPO y el receptor en

superficie de la célula progenitora de glóbulos rojos.

Cuando el cuerpo está en estado sano, el tejido puede obtener oxígeno suficiente de glóbulos rojos ya existentes. En este momento, la concentración de EPO en el cuerpo es muy baja. Esta baja aunque normal concentración de EPO es suficiente para estimular para promover la generación de glóbulos rojos, que normalmente se pierde durante el envejecimiento.

Cuando el nivel de transporte de oxígeno por los glóbulos rojos en el sistema circulatorio se reduce y aparece la hipoxia, la cantidad de EPO en el cuerpo se incrementará. El estado de hipoxia del cuerpo puede ser causado por las siguientes razones: radiación excesiva, captación de oxígeno reducida debido a elevada latitud o coma de larga duración, diversos tipos de anemia y así sucesivamente. Como respuesta al estrés por hipoxia del cuerpo, un nivel más elevado de EPO puede estimular la diferenciación de célula progenitora de glóbulos rojos para intensificar su capacidad de producir glóbulos rojos. Cuando el número de glóbulos rojos en el cuerpo supera la necesidad de tejido normal, el nivel de EPO en el sistema circulatorio se reduce. Es precisamente debido a que la EPO tiene un papel crucial para la formación de glóbulos rojos que estas hormonas tienen un muy amplio prospecto para el tratamiento y el diagnóstico de una enfermedad de la sangre caracterizada por baja generación y defecto de glóbulos rojos. Recientes estudios proporcionan las bases para predecir el efecto de terapia con EPO en diversas enfermedades, trastornos y anomalías hematológicas, incluyendo estas enfermedades: el uso de EPO en el tratamiento de anemia en paciente con insuficiencia renal crónica (IRC) , y administración de EPO a pacientes con SIDA y que reciben quimioterapia (Danna, RP, Rudnick, SA, Abels, RI: editado por MB, Garnick, EPO in Clinical Applications-An International Perspective. Marcel Dekker; 1990: páginas. 301-324) .

Parte de los efectos biológicos de EPO pueden regularse mediante el papel interno de receptores superficiales en la membrana celular. Previamente, cuando se estudiaba la unión de la proteína EPO a la superficie celular usando glóbulos rojos inmaduros aislados del bazo de ratones, se descubrió que esta proteína está compuesta por dos polipéptidos, y su peso molecular es de aproximadamente 85000∼100000 KD (véase Sawyer, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 84: 3690-3694 para una descripción más detallada) . El número de sitios de unión de EPO ya ha sido calculado. Cada membrana celular contiene aproximadamente de 800 a 1000 sitios. En estos sitios de unión, aproximadamente 300 sitios de unión tienen un nivel de Kd de 90 pM. La unión de los sitios de unión restantes es débil, siendo de aproximadamente 570 pM. Algunos estudios han mostrado que, a partir de la respuesta a EPO de glóbulos rojos del bazo de ratones infectados con la cepa de anemia del virus Friend, se identifican aproximadamente 400 sitios de unión, en los que algunos tienen un nivel de Kd alto de 100 pM y algunos tienen un nivel de Kd bajo de 800 pM.

El trabajo subsiguiente es que dos tipos de receptor de EPO son transcritos por un único gen. Dicho gen ha sido clonado ahora. Por ejemplo, las secuencias de ADN y secuencias... [Seguir leyendo]

1. Un derivado peptidomimético de eritropoyetina (EPO) de fórmula general (I) y sus sales farmacéuticamente aceptables,

R1-R2- (CH2) n1-R3- (CH2) n2-R4-R5 (I) en la que R1, R5 se seleccionan entre péptidos cíclicos que tiene las siguientes secuencias:

en las que n1, n2 son números enteros seleccionados independientemente entre de 0 a 10; en las que R2, R4 se seleccionan entre -CO o -CH2;

en las que R3 se selecciona entre NCO (CH2) n4NHR6, CHOCONH (CH2) n5NHR6, o CHSCON (CH2) n5NHR6;

en las que n4 es un número entero seleccionado entre de 2 a 10,

en las que n5 es un número entero seleccionado entre de 2 a 10,

y en las que R6 se selecciona entre H o derivados de metoxi-polietilenglicol.

2. El derivado peptidomimético de EPO de la reivindicación 1 y sus sales farmacéuticamente aceptables, en el que la secuencia de aminoácidos de R1, R5 podría ser uniforme o no uniforme.

3. El derivado peptidomimético de EPO de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y sus sales 10 farmacéuticamente aceptables, en el que los extremos N-terminales de R1, R5 están acetilados.

4. El derivado peptidomimético de EPO de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y sus sales farmacéuticamente aceptables, en el que R1, R5 son péptidos cíclicos ciclados mediante puentes disulfuro.

5. El derivado peptidomimético de EPO de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y sus sales farmacéuticamente aceptables, en el que R1, R5 se seleccionan por separado entre péptidos cíclicos que tienen las siguientes secuencias:

6. El derivado peptidomimético de EPO de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y sus sales farmacéuticamente aceptables, en el que dicho peptidomimético de EPO se selecciona entre el siguiente péptido, en el que

n1, n2 son 2, R2, R4 son -CO, R3 es CHOCONH (CH2) n5NHR6, n5 es 2;

n1, n2 son 1, R2, R4 son -CO, R3 es NCO (CH2) n4NHR6, n4 es 2:

n1, n2 son 2, R2, R4 son -CH2, R3 es CHOCONH (CH2) n5NHR6, n5 es 2; o n1, n2 son 1, R2, R4 son -CH2, R3 es NCO (CH2) n4NHR6, n4 es 2.

7. El derivado peptidomimético de EPO de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y sus sales farmacéuticamente aceptables, caracterizado porque R6es H.

8. El derivado peptidomimético de EPO de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y sus sales farmacéuticamente aceptables, en el que R6 es derivados de metoxi-polietilenglicol, y en el que el peso molecular de los derivados de metoxi-polietilenglicol se selecciona preferentemente entre 5.000 y 100.000 Dalton.

9. El derivado peptidomimético de EPO de la reivindicación 8 y sus sales farmacéuticamente aceptables, en el

que la estructura de los derivados de metoxi-polietilenglicol se selecciona entre el tipo ramificado o lineal, preferentemente los derivados de metoxi-polietilenglicol son de estructura lineal y tienen un peso molecular de 20.000 daltons, o los derivados de metoxi-polietilenglicol son de estructura lineal y tienen un peso molecular de

40.000 daltons.

10. El derivado peptidomimético de EPO de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y sus sales farmacéuticamente aceptables, en el que n1, n2 son 2, R1, R5 se seleccionan entre de la SEC ID Nº 5 a la SEC ID Nº 8, R2, R4 se seleccionan entre -CO, -CH2, R3 es CHOCONH (CH2) n5NHR6, en el que n5 es un número entero seleccionado entre de 2 a 10; R6 es un derivado de metoxi-polietilenglicol con estructura lineal y peso molecular de 20.000 daltons;

n1, n2 son 1, R1, R5 se seleccionan entre de la SEC ID Nº 5 a la SEC ID Nº 8, R2, R4 se seleccionan entre -CO, -CH2, R3 se selecciona entre NCO (CH2) n4NHR6, en el que n4 es un número entero seleccionado entre de 2 a 10; R6 es un derivado de metoxi-polietilenglicol con estructura lineal y peso molecular de 20.000 daltons;

n1, n2 son 2, R1, R5 se seleccionan entre de la SEC ID Nº 5 a la SEC ID Nº 8, R2, R4 se seleccionan entre -CO, -CH2,

R3 es CHOCONH (CH2) n5NHR6, en el que n5 es un número entero seleccionado entre de 2 a 10; R6 es un derivado de metoxi-polietilenglicol con estructura lineal y peso molecular de 40.000 daltons; o n1, n2 son 1, R1, R5 se seleccionan entre de la SEC ID Nº 5 a la SEC ID Nº 8, R2, R4 se seleccionan entre -CO, -CH2, R3 es NCO (CH2) n4NHR6, en el que n4 es un número entero seleccionado entre de 2 a 10; R6 es un derivado de metoxi-polietilenglicol con estructura lineal y peso molecular de 40.000 daltons.

11. El derivado peptidomimético de EPO de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y sus sales farmacéuticamente aceptables, en el que dicho derivado peptidomimético de EPO y sus sales farmacéuticamente aceptables es

12. Un método para la preparación de un derivado peptidomimético de EPO de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y sus sales farmacéuticamente aceptables del mismo, que comprende:

(1) preparar R1H, R5H, en el que R1, R5 se seleccionan entre péptidos cíclicos que tienen las secuencias de la SEC ID Nº 5-8, SEC ID Nº 12-20, SEC ID N.

2. 26, SEC ID N.

2. 30;

(2) preparar una molécula pequeña funcional de fórmula general (II) R7-CO- (CH2) n1-Z2- (CH2) n2-CO-R8 (II)

en la que n1, n2 son números enteros seleccionados independientemente entre de 0 a 10;

R7, R8 se seleccionan entre OH o H;

Z2 se selecciona entre NCO (CH2) n7NHR9, CHOCONH (CH2) n8NHR9, o CHSCON (CH2) n8NHR9, en el que n7 es un número entero seleccionado entre de 2 a 10, n8 es un número entero seleccionado entre de 2 a 10, R9 se selecciona entre Boc o Cbz;

(3) hacer reaccionar a R1, R5 con una molécula pequeña funcional de fórmula (II) a través de amidación o 15 aminación reductora para preparar el compuesto de fórmula (III) ,

R1-R2- (CH2) n1-Z2- (CH2) n2-R4-R5 (III) ,

en el que R2, R4 se seleccionan independientemente entre -CO o -CH2;

(4) después de que se elimina Boc o Cbz, llevar a cabo la reacción de amidación con metoxi-polietilenglicol activo.

13. El método para la preparación de la reivindicación 12, caracterizado porque en dicha fórmula general (II)

n1, n2 son 1 ó 2, R7, R8 son OH, Z2 se selecciona entre NCO (CH2) n7NHR9 o CHOCONH (CH2) n8NHR9, n7 es un número entero seleccionado entre de 2 a 10, n8 es un número entero seleccionado entre de 2 a 10, R9 es Boc; o n1, n2 son 1 ó 2, R7, R8 son H, Z2 se selecciona entre NCO (CH2) n7NHR9 o CHOCONH (CH2) n8NHR9, n7 es un número 25 entero seleccionado entre de 2 a 10, n8 es un número entero seleccionado entre de 2 a 10, R9 es Boc.

14. Una composición farmacéutica que comprende:

(1) una cantidad terapéuticamente eficaz del derivado peptidomimético de EPO de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o sales farmacéuticamente aceptables del mismo, y 46

(2) vehículos farmacéuticamente aceptables.

15. Uso del derivado peptidomimético de EPO de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o sales farmacéuticamente aceptables del mismo o una composición farmacéutica de la reivindicación 14, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos caracterizados por un bajo nivel de EPO o un grupo de glóbulos rojos insuficiente o defectuoso.

16. El uso de la reivindicación 15, en el que dichos trastornos caracterizados por un bajo nivel de EPO o grupo de glóbulos rojos insuficiente o defectuoso son insuficiencia renal avanzada o diálisis; anemia relacionada con el

SIDA, enfermedades autoinmunitarias, o tumor maligno; fibrosis quística; anemia temprana del prematuro; anemia relacionada con enfermedad inflamatoria crónica; lesión de la médula espinal; pérdida de sangre aguda; envejecimiento y cáncer con producción de glóbulos rojos anormales.