Procedimiento para sintetizar timosinas.

Procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables mediante la síntesis en fase sólida sobresoportes poliméricos que comprende las etapas de sintetizar linealmente los péptidos derivados de timus en fase sólida,

incorporaral menos un Thr o Ser en forma de dipéptido de pseudoprolina enla secuencia, obtener las timosinas mediante el tratamiento de peptidil-resina con ácido trifluoroacético, y purificar las timosinas por RP-HPLC. La presente invención protege también el compuesto aislado y/o purificado obtenido por dicho procedimiento así como el uso del mismo en la preparación de un medicamento.

Procedimiento para sintetizar timosinas CAMPO DE LA INVENCIÓN:

Esta invención está dentro del campo de la química biomédica. En particular, la invención se refiere a un nuevo procedimiento de síntesis química de timosinas mediante síntesis de péptidos en fase sólida con un rendimiento y pureza elevados. El procedimiento se basa en la incorporación de derivados de pseudoprolina en posiciones clave de las secuencias de las timosinas. El ciclo oxazolidina de la pseudoprolina impide la estructuración de la cadena peptídica creciente anclada a la resina, evitando la agregación de la peptidil resina y el colapso de la síntesis durante la elongación de la secuencia peptídica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN:

Las timosinas son una familia de polipéptidos bioquímica y funcionalmente diferentes con importantes funciones fisiológicas. Descritas por primera vez en 1966 y originariamente aisladas en el timo, han sido identificadas posteriormente en diversos tejidos y células [Goldstein, A.L., Slater, F.D., White, A., Preparation and partial purification of a thymic lymphocytopoietic factor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1966, 56 (3) , 1010-1017].

Existen diferentes familias de timosinas que desempeñan funciones distintas, por ejemplo las e-timosinas, que tienen localización nuclear y están implicadas en replicación y/o transcripción de DNA y las 1-timosinas, que se localizan en el citoplasma y muestran una gran afinidad por G-actina en procesos implicados en motilidad celular. Las e- y 1-timosinas juegan un importante papel en la regulación de la respuesta inmune, biología vascular y patogénesis del cáncer, presentando un gran potencial terapéutico además de su aplicación en diagnóstico como marcadores moleculares [Goldstein A.L.; Badamchian M., Thymosins: chemistr y and biological properties in health and disease, Expert Opin. Biol. Therapy, 4 (4) , 559-573].

La subfamilia de las e-timosinas está compuesta por e-paratimosina, e-protimosina, e1-timosina y e11-timosina. La más importante es la e1-timosina o timalfasina, originariamente aislada de tejido tímico, es un péptido de 28 aminoácidos, acilado en posición N-terminal y con un grupo ácido en su extremo C-terminal, derivado del precursor 25 e1-protimosina con 111 aminoácidos. Debido a sus propiedades inmunoreguladoras, e1-timosina ha sido utilizada para el tratamiento de enfermedades en las que el sistema inmunitario está afectado; principalmente en hepatitis B, C y carcinoma hepático. La hepatitis B crónica es una enfermedad relacionada con una disfunción del sistema inmune, conlleva un alto riesgo de padecer cirrosis y carcinoma hepatocelular. La e1-timosina actúa como modulador del sistema inmunitario activando la producción de células NK en varios modelos animales y humanos e incrementado la producción de células CD3, CD4 y CD8 en enfermos con hepatitis crónica B y cáncer. Activa también la producción de citoquinas Th1, relacionadas con una fuerte respuesta inmune antiviral.

Numerosos modelos celulares in vitro avalan el potencial terapéutico de la e1-timosina. El tratamiento con e1timosina reduce la replicación del VIH-1 y del virus parainfluenza en cultivos celulares primarios [Colledge, D., Wang,

Y. Tuthill C.; Locarnini, S. Antiviral effects of thymosin alpha 1 versus leukocytic interferon in primar y cultures of duck

hepatocytes persistently infected with duck HBV in vitro, Second international conference on therapies for viral hepatitis, 1997; Kona, Hawai; Palamara, A. Bue M., Savini, P., Thymosin alpha 1 inhibits Sendai virus replication: involvement of intracellular redox state, 6th International Expert Forum of Immunotherapy and Gene Therapy; May 1998, Florence, Italy]. Además reduce el estrés oxidativo aumentando los niveles de glutación intracelular cuya baja concentración en pacientes con el VIH está relacionada con un bajo índice de supervivencia [Giuliani, C., Napolitano,

G., Mastino, A., Thymosin alpha-1 regulates MHC class I expression in FRTL-5 cells at transcriptional level, Eur. J. Immunol. 2000, 30, 778-786] . La e1-timosina aumenta los niveles de expresión de MHC clase 1 en cultivos celulares, manteniendo la capacidad del sistema inmune para responder a agentes infecciosos [Herzenberg, L.A.; De Rosa, S.C.; Dubs, J.G., Glutathione deficiency is associated with impaired survival in HIV disease, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 1967-1972].

En modelos animales de infección, el potencial terapéutico de e1-timosina ha sido puesto de manifiesto en ratones infectados con varios patógenos (Listeria monocitogenes, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcescens) y en ratones inmunodeprimidos con 5-fluorouracilo [Ishitsuka, H; Umeda, Y. Nakamura, J. Yagi, Y. Protective activity of thymosin against opportunistic infections in animal models. Cancer Immunol. Immunother. 1983, 14, 145-150]. Así, en estudios con modelos animales de hepatitis B crónica (woodchuck hepatitis virus) en los que 50 los animales siguieron un tratamiento con e1-timosina, la concentración del virus en suero fue reducida en un 99% [Gerin, J.L., Korba, B.E., Cote P.J., Tennant, B.C., A preliminar y report of a controlled study of thymosin alpha 1 in the woodchuck model of hepanavirus infection. In: Block T., ed. Innovations in antiviral development and the detection of virus infection. Philadelphia, Pa: Jefferson Medical; 1992, 121-123; Tennant, B.V., Korba, B.E., Baldwin B.H., Goddard, L.A., Hornbuckle W.E., Cote, P.J., Treatment of chronic woodchuck hepatitis virus infection with

thymosin alpha-1 (TA1) . Antiviral Res. 1993; 20 (suppl 1) , 1634], disminuyendo dicho tratamiento el riesgo de muerte por carcinoma hepatocelular. Asimismo e1-timosina aumenta la supervivencia de animales adultos o inmunodeprimidos infectados con el virus herpes simple, el virus influenza o Candida albicans [Effros, R.B., Casillas, A., Wadlford, R.L., The effect of thymosin alpha 1 on immunity to influenza in aged mice. Aging: immunology and infectious disease. Vol 1. New York, N.Y.: Mar y Ann Liebert, Inc; 1988; 31-40; Bistoni, F., Marconi, P., Frati, L., Bonmassar, E., Garaci, E. Increase of mouse resistance to candida albicans infection by thymosin alpha1. Infect. Immun. 1982, 36, 609-614].

El efecto sinérgico de e1-timosina con otras citoquinas en el tratamiento de la hepatitis C ha sido puesto de manifiesto en ensayos con ratones infectados con el virus influenza A tratados con una combinación de e1-timosina, interferón IFNe/1 y el antiviral amantadina. La combinación de los tres compuestos mejora sustancialmente el porcentaje de supervivencia [D’Agostini C., Palamara, A.T., Favalli, C. Efficacy of combination therapy with amantadine, thymosin alpha 1 and alpha/beta interferon in mice infected with influenza A virus. Int. J. Immunopharmacol. 1996, 16, 95-102].

Un estudio en el que se estudió comparativamente el efecto del tratamiento con e1-timosina o interferón IFN e-2b en pacientes difíciles de tratar con un mutante del virus de la hepatitis B muestra casi el doble de eficacia en eliminación del virus con e1-timosina. En contraposición al IFNe-2b, la e1-timosina es mejor tolerada y además no presenta efectos secundarios significativos en personas inmunodeprimidas [Andreone, P., Cursaro, C., Gramenzi, A., A randomized controlled trial of thymosin alpha 1 versus interferon alpha treatment in patients with hepatitis B antigen antibody and hepatitis B virus DNA, positive chronic hepatitis B, Hepatology, 1996, 24, 774-777]. Mientras interferón produce una rápida respuesta durante el tratamiento, cepas resistentes del virus provocan la recaída del paciente, la e1-timosina tiene un efecto más retardado, relacionado con una mejora del sistema inmunitario a largo plazo [Garaci, E., Milanese, G., Vella, S., A randomized controlled study for the evaluation of the activity of a triple combination of zidovudine, thymosin alpha 1 and interferon alpha in HIV-infected individuals with CD4 counts between 200 and 500 cells/mm3, Antiviral Therapy, 1998, 3, 103-11].

En modelos animales de cáncer, la e-timosina ha demostrado su eficacia en la prevención de cáncer intestinal [Moody, T.W., Leyton, J., Zia, F., Tuthill, C., Badamchian, M. Goldstein, A.L., Thymosin alpha1 is chemopreventive for lung adenoma formation in A/J mice, Cancer Lett. 2000, 155, 121-127], cáncer de mama, reduciendo la incidencia de desarrollo del cáncer como resultado de la estimulación del sistema immunitario en ratas [Moody, T.W., Tuthill, C., Badamchian, M., Goldstein, A.L., Thymosin alpha1 inhibits mammar y carcinogenesis in Fisher rats, Peptides, 2002, 23 (5) , 1011-1014] y glioblastoma [Patente WO03049697, Thymosin-alpha1 is used as an adjuvant in combination with carmustine (BCNU) as an effective treatment for malignant... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables mediante síntesis en fase sólida sobre soportes poliméricos caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a. sintetizar linealmente los péptidos derivados de timus en fase sólida sobre una resina aplicando la metodología Fmoc/tBu,

b. incorporar al menos una Thr o Ser en forma de dipéptido pseudoprolina en la secuencia,

c. obtener las timosinas mediante el tratamiento de peptidil-resina con ácido trifluoroacético que provoca de forma simultánea ruptura del enlace péptido-resina, desprotección de las cadenas laterales y apertura del ciclo de pseudoprolina,

d. purificar las timosinas por RP-HPLC.

2. Un procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables según la reivindicación 1, caracterizado por que se obtienen a-timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables.

3. Un procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables según la reivindicación 1, caracterizado por que se obtienen º-timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables.

4. Un procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables según la reivindicación 1, caracterizado por que la síntesis se realiza sobre soportes poliméricos.

5. Un procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables según la reivindicación 1, caracterizado por que en la etapa a) se utiliza una resina de tipo cloro-tritilo de funcionalización 0.1-2 mmol/g.

6. Un procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables según la reivindicación 1, caracterizado por que en la etapa a) se utiliza una resina de tipo pMBHA de funcionalización 0.1-2 mmol/g.

7. Un procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables según la reivindicación 1, caracterizado por que en la etapa b) la incorporación de Ser o Thr se lleva a cabo en forma de dipéptidos pseudoprolina y/o Ser o Thr modificadas en forma de pseudoprolina en la peptidil-resina.

8. Un procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que el dipéptido pseudoprolina se adiciona en una región de aminoácidos hidrofóbicos.

9. Un procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que si tras la etapa c) aparece el aminoácido Met en la secuencia, se realiza adicionalmente un tratamiento de destercbutilación del crudo con AcOH.

10. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que las timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad con las secuencias SEQ.ID.N.1 a SEQ.ID.N.11 sobre toda su longitud.

11. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que las timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables consisten en una secuencia de aminoácidos elegida del grupo formado por las secuencias SEQ.ID.N.1 a SEQ.ID.N.11 y sus secuencias complementarias.

12. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que las timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables incluyen fragmentos de al menos una secuencia de aminoácidos elegida del grupo formado por las secuencias SEQ.ID.N.1 a SEQ.ID.N.11 y sus secuencias complementarias.

13. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que todos o alguno de los aminoácidos comprendidos en las secuencias SEQ.ID.N.1 a SEQ.ID.N.11 se seleccionan del grupo formado por Laminoácidos, D-aminoácidos, N-metil aminoácidos, aminoácidos no naturales, Met-tBu o Met-oxidada.

14. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que las timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables incluyen modificaciones en el aminoácido N-terminal seleccionadas de acilaciones y/o pegilaciones.

15. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende la etapa adicional de preparación de un medicamento que comprende dichas timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables.