Formulación líquida de conjugado de G-CSF.

Una preparación acuosa que comprende como agente activo, un conjugado polímero-G-CSF que tiene la siguiente fórmula:

en donde AA es treonina 133 o treonina 134 si está presente una metionina en el N terminal de G-CSF; y en donde f es un número entero seleccionado de 1 a 2500, polisorbato 20 y/o polisorbato 80 como tensioactivo, sorbitol y/o manitol como modificador de la tonicidad, acetato como tampón y sodio, y ningún otro excipiente, en donde la preparación tiene un pH en el intervalo de 4,5 a 5,5.

Formulaciïn lïquida de conjugado de G-CSF

La presente invenciïn se refiere a una composiciïn farmacïutica lïquida que comprende un polipïptido factor estimulante de colonias de granulocitos conjugado con un polïmero, teniendo la composiciïn un valor de pH en el intervalo de 4, 5 a 5, 5. La composiciïn comprende ademïs un tensioactivo y opcionalmente uno o mïs de otros excipientes farmacïuticamente aceptables. Ademïs, la composiciïn de la invenciïn estï libre de ïcido tartïrico o sales del mismo y de ïcido succïnico y sales del mismo como agentes tamponantes y no contiene aminoïcidos como estabilizantes. La composiciïn presenta una buena estabilidad durante el almacenaje y es especialmente ïtil para la profilaxis y tratamiento de trastornos e indicaciones mïdicas en las que las preparaciones del factor estimulante de colonias de granulocitos se consideran remedios ïtiles.

El factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) es un factor de crecimiento hematopoyïtico que estimula la proliferaciïn y la diferenciaciïn de las cïlulas precursoras hematopoyïticas y la activaciïn de los neutrïfilos maduros. El G-CSF es capaz de reforzar la proliferaciïn de los neutrïfilos in vitro e in vivo. La forma humana de G-CSF fue clonada por grupos de Japïn y Estados Unidos en 1986 (vïase, p.ej., Nagata et al. (1986) Nature 319: 415

- 418) . La glucoproteïna humana natural existe en dos formas, una que tiene 174 aminoïcidos y la otra que tiene 177 aminoïcidos. La forma de 174 aminoïcidos, mïs abundante y mïs activa, ha sido utilizada en el desarrollo de productos farmacïuticos por tecnologïa de ADN recombinante.

Se han producido grandes cantidades de G-CSF recombinante mediante ingenierïa genïtica en Escherichia coli y han sido utilizadas satisfactoriamente en aplicaciones clïnicas para tratar a pacientes de cïncer que padecen neutropenia inducida por la quimioterapia. El G-CSF producido por Escherichia coli es una cadena polipeptïdica de 175 aminoïcidos que contiene una metionina extra en su N terminal. Esta proteïna ha sido producida mediante la expresiïn de un gen G-CSF en E. coli y la purificaciïn del producto proteico hasta homogeneidad. Es una proteïna hidrïfoba que tiene cinco residuos de cisteïna, cuatro de los cuales estïn implicados en enlaces disulfuro. El residuo de cisteïna libre estï generalmente implicado en la formaciïn de agregados de peso molecular mïs alto despuïs de almacenaje en soluciïn. Los agregados de las proteïnas se pueden formar tambiïn a partir de formas oxidadas de la proteïna que surgen por oxidaciïn de los residuos internos de metionina en la secuencia primaria de la proteïna. De los cuatro residuos de metionina, uno estï en el N terminal y los otros tres son internos. Las formas oxidadas de la proteïna que contienen metionina oxidada en la posiciïn 122 se pueden separar de las formas que contienen metioninas oxidadas en las posiciones 127 o 138 y de la proteïna nativa por procedimientos regulares de separaciïn por HPLC de fase inversa (las posiciones se calculan para el metionil-G-CSF que consta de 175 aminoïcidos) .

El G-CSF humano recombinante sintetizado en un sistema de expresiïn de E. coli se denomina filgrastim (denominaciïn comïn internacional, INN) . La estructura de filgrastim difiere ligeramente de la glucoproteïna natural. La otra forma de G-CSF humano recombinante se denomina lenograstim (INN) y se sintetiza en cïlulas de ovario de hïmster chino (CHO) . Filgrastim y lenograstim estïn comercializados en Europa con los nombres de fïbrica Neupogenï y Granocyte, respectivamente.

Sin embargo, las formas disponibles comercialmente de G-CSF humano recombinante tienen un efecto farmacolïgico de vida corta y a menudo se deben administrar mïs de una vez al dïa durante la duraciïn del estado leucopïnico. Una molïcula con una semivida de circulaciïn mïs larga reducirïa el nïmero de administraciones necesarias para aliviar la leucopenia y evitarïa las consiguientes infecciones. Otro problema con los productos de G-CSF humano recombinante actualmente disponibles es la apariciïn de dolor ïseo dependiente de la dosis. Puesto que el dolor ïseo es experimentado por los pacientes como un importante efecto secundario del tratamiento con G-CSF humano recombinante, serïa deseable proporcionar un producto de G-CSF humano recombinante que no cause dolor ïseo, ya sea por medio de un producto que inherentemente no tenga este efecto o que sea eficaz en una dosis que sea suficientemente pequeïa para que no se produzca dolor ïseo o al menos se reduzca. Por lo tanto, existe claramente la necesidad de mejorar las molïculas de G-CSF recombinante y las preparaciones farmacïuticas que contienen molïculas de G-CSF recombinante como preparaciones estables listas para su uso.

Se han presentado informes de variantes de G-CSF humano obtenidas con tïcnicas de ingenierïa genïtica de proteïnas, p.ej. se describen variantes de G-CSF en los documentos WO 01/87925, EP 0 456 200 A, US 6.166.183, US 6.004.548, US 5.580.755, US 5.582.823, US 5.675.941, US 5.416.195, US 5.399.345, WO 2005/055946 y WO 2006/074467.

Se ha descrito tambiïn la modificaciïn de G-CSF humano y otros polipïptidos para de este modo introducir al menos una cadena de carbohidratos adicional en comparaciïn con el polipïptido nativo (documento US 5.218.092) . Ademïs, se han descrito y estudiado modificaciones polimïricas del G-CSF humano nativo, incluyendo la uniïn de grupos poli (etilenglicol) (PEG) (documentos US 5.824.778, US 5.824.784, WO 96/11953, WO 95/21629 y WO 94/20069) .

Se acepta generalmente que se puede mejorar la estabilidad de las proteïnas y que se puede reducir la respuesta inmunitaria frente a estas proteïnas cuando estas proteïnas se acoplan a molïculas polimïricas. El documento WO 94/28024 describe que proteïnas fisiolïgicamente activas modificadas con PEG presentan inmunogenicidad y antigenicidad reducidas y circulan en el torrente sanguïneo durante un tiempo considerablemente mïs largo que las proteïnas no conjugadas, esto es, tienen una velocidad de aclaramiento reducida.

Es conocida en la tïcnica la uniïn de polïmeros sintïticos a la cadena principal peptïdica en un intento de mejorar las propiedades farmacocinïticas de los productos terapïuticos de glucoproteïna. Un ejemplo de polïmero que ha sido conjugado con pïptidos es el PEG. Se ha demostrado que el uso de PEG para derivatizar productos terapïuticos peptïdicos reduce la inmunogenicidad de los pïptidos. Por ejemplo, la patente de Estados Unidos nïmero 4.79.337 describe polipïptidos no inmunogïnicos tales como enzimas y hormonas peptïdicas acopladas al PEG o al poli (propilenglicol) (PPG) . En adiciïn a la reducciïn de la inmunogenicidad, se prolonga el tiempo de aclaramiento en circulaciïn debido al aumento de tamaïo del conjugado con PEG de los polipïptidos en cuestiïn.

El pegfilgrastim (INN) es un conjugado covalente de G-CSF humano recombinante metionilado (filgrastim) y una ïnica molïcula de monometoxi-PEG de 20 kDa. La molïcula de monometoxi-PEG estï unida covalentemente al residuo metionilo en N terminal de filgrastim. El pegfilgrastim se comercializa en Europa con el nombre de fïbrica Neulastaï.

El principal modo de uniïn de PEG, y sus derivados, a los pïptidos es una uniïn no especïfica a travïs de un residuo de aminoïcido peptïdico (vïase p.ej. los documentos US 4.088.538, US 4.496.689, US 4.414.147, US

4.055.635 y WO 87/00056) . Otro modo de uniïn del PEG a los pïptidos es a travïs de la oxidaciïn no especïfica de residuos glucosilo de un glucopïptido (vïase p.ej. el documento WO 94/05332) .

En estos mïtodos no especïficos, se aïade el PEG de una manera aleatoria, no especïfica a los residuos reactivos de una cadena principal peptïdica. La adiciïn aleatoria de molïculas de PEG tiene sus inconvenientes, incluida una falta de homogeneidad del producto final, y la posibilidad de que se reduzca la actividad biolïgica o enzimïtica del pïptido. Por lo tanto, durante los ïltimos aïos se han realizado esfuerzos para desarrollar mïtodos mïs especïficos del sitio para unir un polïmero sintïtico u otra marca a un pïptido y se ha encontrado que se pueden producir in vitro productos terapïuticos peptïdicos homogïneos, conjugados especïficamente, a travïs de la acciïn de enzimas. Estas conjugaciones a base de enzimas tienen las ventajas de regioselectividad y estereoselectividad. Dos clases principales de enzimas para uso en la sïntesis de pïptidos conjugados son las glucosiltransferasas (p.ej. sialiltransferasas, oligosacariltransferasas, N-acetilglucosaminiltransferasas) y las glucosidasas. Estas enzimas se pueden utilizar para la uniïn especïfica de azïcares que se pueden... [Seguir leyendo]

1. Una preparaciïn acuosa que comprende como agente activo, un conjugado polïmero-G-CSF que tiene la siguiente fïrmula:

en donde AA es treonina 133 o treonina 134 si estï presente una metionina en el N terminal de G-CSF; y en donde f es un nïmero entero seleccionado de 1 a 2500, polisorbato 20 y/o polisorbato 80 como tensioactivo, sorbitol y/o manitol como modificador de la tonicidad, acetato como tampïn y sodio, y ningïn otro excipiente, en donde la preparaciïn tiene un pH en el intervalo de 4, 5 a 5, 5.

2. La preparaciïn acuosa segïn la reivindicaciïn 1, en donde el tensioactivo estï presente en una concentraciïn de10 0, 0001 % (p/v) - 0, 05 % (p/v) .

3. La preparaciïn acuosa segïn la reivindicaciïn 1 o la reivindicaciïn 2, en donde el pH estï en el intervalo de 4, 7 a 5, 3.

4. La preparaciïn acuosa segïn una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el pH estï en el intervalo de 4, 9 a 5, 1.

5. La preparaciïn acuosa segïn una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el conjugado polïmero-G-CSF estï presente en una concentraciïn de 1-20 mg/mL, preferiblemente d.

8. 12 mg/mL.

6. Un recipiente farmacïutico que contiene una preparaciïn acuosa segïn una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

7. El recipiente farmacïutico segïn la reivindicaciïn 6, en donde el recipiente es una jeringa, vial, botella de

perfusiïn, ampolla, cartucho (carpoule) , jeringa equipada con un sistema de protecciïn de la aguja, o un cartucho dentro de una pluma de inyecciïn.

8. El procedimiento para preparar una preparaciïn acuosa segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el conjugado polïmero-G-CSF como agente activo, se formula en una preparaciïn acuosa que tiene un pH en el intervalo de 4, 5 a 5, 5 y que comprende polisorbato 20 y/o polisorbato 80 como tensioactivo, sorbitol y/o manitol

como modificador de la tonicidad, acetato como tampïn y sodio.

9. El procedimiento para preparar una preparaciïn acuosa segïn la reivindicaciïn 8, en donde la preparaciïn acuosa se diluye de 1:2 a 1:8.

10. La preparaciïn acuosa segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para uso en el tratamiento o prevenciïn

de la neutropenia, en el tratamiento o prevenciïn de trastornos neurolïgicos, en relaciïn con el trasplante de mïdula 30 ïsea, o para la movilizaciïn de cïlulas madre.

11. La preparaciïn acuosa obtenible por el procedimiento segïn la reivindicaciïn 9, para uso pediïtrico.