Endostatina humana recombinante modificada y su aplicación.

Una endostatina recombinante modificada que tiene una estructura de:

CH3O-(CH2CH2O)m-CH2CH2CH2-NαH-Endostar,

en donde el peso molecular medio ponderal de CH3O-(CH2CH2O)m-CH2CH2CH2- es 20 kD-40 kD; y la secuencia de aminoácidos de Endostar es la SEQ ID.NO.1 o la SEQ ID.NO.2.

Endostatina humana recombinante modificada y su aplicación.

Fundamento de la invención

Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la biofarmacia y en particular a una endostatina humana recombinante modificada y su aplicación.

Técnica relacionada Desde el punto de vista de la "dependencia del crecimiento tumoral de la neoangiogénesis" propuesto por el Profesor Folkman en 1971, es posible controlar el crecimiento tumoral bloqueando la neoangiogénesis, para conseguir el objeto de inhibir la invasión tumoral, la recidiva y la metástasis, creando así un nuevo campo en la terapia de tumores.

En 1997, O'Reilly, et al., en la Universidad de Harvard encontraron que el medio de cultivo de células endoteliales de hemangioendotelioma de ratón tenía un efecto inhibidor sobre los endoteliocitos, y por purificación, dicha especie activa exhibía inhibición del crecimiento, dependiente de la dosis, de los endoteliocitos, específicamente en cierto intervalo de concentraciones (100 ng/ml-600 ng/ml) . La secuenciación de los aminoácidos terminales del extremo N indicó que, dicha especie es un fragmento terminal del extremo C del colágeno XVIII, con un peso molecular de aproximadamente 20 kD, y dicha proteína se denomina endostatina (ES) .

Los estudios muestran que la endostatina puede controlar eficazmente el crecimiento, la infiltración y la metástasis de diversos tumores sólidos, tales como el carcinoma de pulmón no microcítico, el cáncer de colon, el glioma cerebral, el fibroma, el mesotelioma y linfomas malignos. Actualmente, la endostatina se obtiene por un método de ingeniería genética. Debido al coste demasiado alto de la expresión de endostatina por hongos, hay una tendencia hacia la utilización de E. coli como sistema de expresión, pero la proteína expresada tiene el problema de una baja renaturalización y similares. Con este objeto se inician los intentos de modificar la estructura de la endostatina natural. Luo Yongzhang, et al., añadieron 9 aminoácidos al extremo N de la endostatina natural y como resultado, se potenció la estabilidad de la ES, y se prolongó su semivida, se mejoró su bioactividad, y la renaturalización de la proteína es mayor que la del método general de producción. Este medicamento ha sido comercializado, con el nombre comercial Endostar. La endostatina humana producida recombinantemente consiste en 192 aminoácidos, y su secuencia de aminoácidos es:

(M) GGSHHHHHHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADR AAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAP SATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK, en la cual, cuando es expresada por E. coli, Met en el extremo N puede estar suprimido en algunos casos (SEQ ID NO.1 o SEQ ID NO.2) .

Los experimentos clínicos en fase III indican que la endostatina modificada puede tener cierto efecto sinérgico cuando se usa en combinación con un fármaco genérico quimioterapéutico y ser capaz de prolongar la progresión de tumores en pacientes.

Experimentos clínicos confirman que la endostatina tiene pocos efectos adversos y es adecuada en combinación con radioterapia y quimioterapia. Sin embargo, como proteína de pequeño tamaño molecular, la endostatina tiene propiedades inestables y estudios indican que la endostatina se degrada probablemente en condiciones anóxicas (después que la endostatina se incuba junto con endoteliocitos en un ambiente de hipoxia durante 48 horas, el contenido disminuirá en aproximadamente 20%) . El ambiente en el interior del tumor es un ambiente de hipoxia, siendo por tanto particularmente favorable para ejercer su actividad. Por otra parte, actualmente la dosis clínica de Endostar es tan alta como 7, 5 mg/m2 y se administra por goteo intravenoso durante 3-4 horas al día. Los experimentos muestran que cuando se administra por inyección intraperitoneal, la endostatina se elimina en 2 horas. Estos datos indican que, después de ser introducida en el organismo, la endostatina puede ser hidrolizada por las enzimas proteolíticas, particularmente en el sitio del tumor en el que el fármaco desempeña el papel farmacodinámico. Por tanto es un problema que hay que resolver urgentemente cómo proteger la molécula de proteína contra la enzimólisis y reducir su eliminación, reduciendo de este modo la dosificación.

El polietilenglicol (PEG) es un polímero seguro, no activo y no tóxico. Por unión covalente a la proteína para modificación química, la pegilación es capaz de superar eficazmente las desventajas de los fármacos de naturaleza proteica en la aplicación clínica, por ejemplo prolonga la semivida en plasma, aumenta la biodisponibilidad, reduce la inmunogenicidad de la proteína, mejora el efecto curativo de los fármacos y su inocuidad y así sucesivamente, al mismo tiempo que mantiene la actividad biológica de la proteína natural. Hasta ahora, los fármacos polipeptídicos con la proteína modificados con PEG que han sido comercializados satisfactoriamente incluyen adenosinadesaminasa (Adagen®) , asparaginasa (OncasPar®) , interferón α-2b (PEG-intron®) , interferón α-2a (Pegasys®) etc., y también están actualmente en estudios clínicos más de 20 fármacos tales como, uricasa, hirudina, interleuquina-2 y interleuquina-6.

Durante la pegilación de la proteína, las moléculas de PEG activadas se acoplan a los grupos amino libres, principalmente de Lys, de la molécula de proteína. Debido a que no hay solamente un grupo amino libre en la cadena proteínica, en los productos de reacción hay varios tipos de productos modificados, tales como, productos monomoleculares, bimoleculares e incluso trimoleculares. Además, los productos modificados también incluyen muchos tipos de isómeros. Comparados con los productos modificados monomoleculares, la pérdida de actividad de los productos modificados multimoleculares es mayor, conduciendo por tanto no solo al desperdicio de los sustratos de reacción, sino también a la reducción de la actividad global de los productos de reacción. El problema de los productos modificados multimoleculares puede ser resuelto controlando las condiciones de reacción y adoptando medios de purificación, para obtener productos modificados monomoleculares. Sin embargo, aún así persiste el problema de isómeros en la modificación monomolecular. Además, puede haber gran diferencia en la bioactividad de los isómeros, y la mezcla de los isómeros por lo general es difícil de purificar. Por tanto, es deseable conseguir una modificación dirigida al sitio controlando las condiciones de reacción, para favorecer la purificación y los estudios de las propiedades de los productos. Además, la modificación dirigida al sitio es más favorable para mantener la actividad de la proteína. Un método inventado por Kinstler es aprovechar el valor menor del pKa de un grupo αamino en el extremo N que el del grupo amino de la lisina. Se obtiene el Pegfilgrastim® modificando el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) con PEG-acetaldehído.

Y. Ling et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 361 (2007) , 79-84, describen que la endostatina humana recombinante Endostar ejerce un efecto antiangiogénico mediante el bloqueo de la fosforilación de tirosina inducida por VEGF en KDR/Flk-1 de células endoteliales.

O. Kinstler et al., Advanced Drug Deliver y Reviews 54 (2002) , 477-485, describen un estudio sobre conjugados de mono-N-terminal poli (etilenglicol) -proteína.

Yongjun Nie et al., Bioconjugate Chem. 2006, 17, 995-999, describen un estudio sobre la preparación y estabilidad de Endostatina humana recombinante monopegilada en el extremo N.

El documento de patente EP 1 985 302 A1 se refiere a un conjugado formado por un agente modificante y una endostatina, en donde dicho agente modificante es capaz de aumentar ls emi-vida in vivo de dicha endostatina.

El documento de patente CN 1 891 717 A se refiere a un método de modificación química para Endostatina rh recombinante humana usando mPEG-propionaldehído para combinarse con el grupo amino libre de un aminoácido B-terminal de Endostatina rh.

El documento de patente CN 101 002 946 A describe una medicina antineoplásica para tratar un tumor o preparar una medicina compuesta antineoplásica.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una endostatina humana recombinante modificada CH3O- (CH2CH2O) m-CH2CH2CH2- NαH-Endostar, que potencia la estabilidad de Endostar in vivo, aumenta la concentración eficaz del fármaco en sangre, prolonga la semivida y reduce la dosificación del fármaco. El peso molecular medio ponderal de CH3O- (CH2CH2O) m- CH2CH2CH2-es 20 kD-40 kD, un peso molecular medio ponderal preferido... [Seguir leyendo]

1. Una endostatina recombinante modificada que tiene una estructura de: CH3O- (CH2CH2O) m-CH2CH2CH2-NαH-Endostar,

en donde el peso molecular medio ponderal de CH3O- (CH2CH2O) m-CH2CH2CH2- es 20 kD-40 kD; y la secuencia de 5 aminoácidos de Endostar es la SEQ ID.NO.1 o la SEQ ID.NO.2.

2. La endostatina recombinante modificada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el peso molecular medio ponderal de CH3O- (CH2CH2O) m-CH2CH2CH2- es 20 kD.

3. La endostatina recombinante modificada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el peso molecular medio ponderal de CH3O- (CH2CH2O) m-CH2CH2CH2- es 40 kD.

4. Una aplicación de la endostatina recombinante modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la preparación de fármacos anti-tumorales.