Interferón alfa 2a modificado por polietilenglicol, su proceso de síntesis y su aplicación.

Interferón-aα2a PEGilado (IFN-α2a) de la estructura de debajo,

obtenido por enlace de IFN-α2a con un polietilenglicolramificado con forma de Y (YPEG):

donde,

Pa y Pb son polietilenglicol (PEG) iguales o diferentes;

j es un número entero entre 1-12;

Ri es H, grupo alquilo C1-C12 sustituido o no sustituido, arilo sustituido, aralquilo, o heteroalquilo; y

X1 y X2 son independientemente un grupo de unión, donde X1 es (CH2)n, y X2 es seleccionado del grupo que consisteen (CH2)n, (CH2)nOCO, (CH2)nNHCO, y (CH2)nCO, donde n es un número entero entre 1-10, donde el YPEG se une aIFN-α2a vía un enlace amido formado por la cadena lateral del grupo ε-amino del residuo de Lys en IFN-α2acorrespondiente a la posición 134 en la SEC ID nº 1.

Interferón alfa 2a modificado por polietilenglicol, su proceso de síntesis y su aplicación

Campo de la invención

La presente invención se refiere a interferón a-2a modificado por polietilenglicol ramificado con forma de Y (PEG) en un único residuo de aminoácido y su preparación, al igual que el uso del IFN-a2a PEGilado preparado en un único residuo de aminoácido en el campo farmacéutico.

Antecedentes de la invención

Interferones (IFN) son una familia de proteínas de molécula pequeña o glicoproteínas producida por células eucariotas en respuesta a infección vírica y otros estímulos antigénicos, que muestran efectos antivíricos, antiproliferativos e inmunomoduladores de amplio espectro. Los IFN han sido ampliamente aplicados en el tratamiento de varias condiciones y enfermedades, tales como infecciones víricas, por ejemplo, hepatitis B, hepatitis C y VIH; trastornos y enfermedades inflamatorios, por ejemplo, esclerosis múltiple, artritis, asma, fibrosis cística y enfermedad de pulmón intersticial; y tumores, por ejemplo, mielomas, linfomas, cáncer de hígado, cáncer pulmonar, leucemia de células pilosas, y así sucesivamente en (Kenji Oritani, Paul W Kincade, et al. Type I interferon and limitin: a comparison of structures, receptors, and functions. Cytokine and Growth Factor Reviews, 12, 337-348, 2001; Yu-Sen Wang, Stephen Youngster, et al. Structural and biological characterization of PEGylated recombinant interferon alpha-2b and its therapeutic implications. Advance Drug Deliver y Reviews, 54, 547-570, 2002) .

Los IFN se clasifican en cuatro tipos según sus diferencias en propiedades químicas, inmunológicas y biológicas: interferón-a, r, y y E. Interferón-a (IFN-a) se segrega por leucocitos. IFN-a humanos se codifican por una familia multigénica que consiste en aproximadamente 20 genes, las proteínas codificadas comparten sobre aproximadamente 90% de homología de secuencia de aminoácido (Henco K., Brosius F.J., et al. J. Mol. Biol., 185, 227-260, 1985) . IFNa2a humano es uno de los subtipos de la subfamilia a2 de la familia de IFN-a humano y es una proteína monocatenaria con varias actividades biológicas. La única proteína de cadena consiste en 165 residuos de aminoácidos, como se muestra en la SEC ID n° 1, en la que el aminoácido N-terminal es Cys con un grupo E-NH2 libre, y los residuos en las posiciones 23, 31, 49, 70, 83, 112, 121, 131, 133, 134 y 164 de la secuencia de aminoácidos son Lys, cada uno de los cuales contiene un grupo E-NH2 libre.

Los IFN normalmente son administrados parenteralmente en tratamientos clínicos. La vida media in vivo corta (24h) y inmunogenicidad fuerte de IFN suponen un intervalo de dosificación más corto y una frecuencia de dosificación más alta. Como los anticuerpos generados significativamente reducen la eficacia terapéutica, es difícil de conseguir eficacia clínica ideal. La tecnología de modificación de polietilenglicol (PEG) desarrollada en los últimos años ha proporcionado una solución posible a los problemas anteriores.

PEG es un polímero orgánico biodegradable e inerte no tóxico, y es importante en los campos de ambas biotecnología y farmacéutica. Técnica de modificación PEG es para unir PEG a una proteína activa vía enlace covalente. Después de la PEGilación, las propiedades de la proteína pueden mejorarse significativamente, por ejemplo, la prolongación de vida media metabólica del fármaco, la reducción de inmunogenicidad, el aumento de seguridad, la mejora de eficacia terapéutica, la reducción de frecuencia de dosificación, el aumento de solubilidad solubilidad/agua del fármaco, el aumento de resistencia contra la proteólisis, la facilitación de liberación controlada del fármaco, etcétera. Para detalles adicionales consulte Inada et al. J. Bioact. and Compatible Polymers, 5, 343, 1990, Delgado et al. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9, 249, 1992, Katre. Advanced Drug Deliver y Systems, 10, 91, 1993 y la publicación de patente U.S. UP 4179337.

Se describe en la patente US n° 4179337, después de unión de PEG a una enzima o insulina, la inmunogenicidad de la proteína fue reducida, mientras simultáneamente las actividades de la proteína fueron reducidas también. Esto también se encontró en G- CSF (Satake-Ishikawa et al. Cell Structure and Function, 17, 157-160, 1992) , IL-2 (Katre et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1487, 1987) , TNF-a (Tsutsumi et al. Jpn. J.J. Cancer Res., 85, 9, 1994) , IL-6 (Inoue et al. J. Lab. Clin. Med., 124, 529, 1994) y CD4-IgG (Chamow et al. Bioconj. Chem., 5, 133, 1994) .

Habitualmente muchos tipos de proteínas pegiladas han sido aplicados clínicamente. En 1990, la adenosinadesaminasa bovina pegilada (Adagen) producida por ENZON Inc. fue aprobada por FDA, y usada para tratar enfermedad de inmunodeficiencia severa combinada (pegfamg013102LB, http://%wvw.fda.gov) . En 1994, otra proteína PEG-modificada para tratar leucemia linfoblástica aguda, la asparaginasa pegilada (pegaspargase, Oncaspar) , fue también comercializada en EEUU (103411s50521b1, http://www.fda.gov) . El interferón-a2b modificado por PEG (PEG IFN-a2b, PEG-intrón) desarrollado por Schering-Plough fue aprobado por FDA para mercadeo en 2000 y el interferón-a pegilado (PEG IFN-a2a, Pegasys) producido por Hoffman-la Roche Ltd. fue también aprobado para mercadeo en 2002, ambos se usan para tratar hepatitis (103964s50371b1, pegsche011901LB, htt://www.fda.gov) . En 2002, el factor de estimulación de colonia de granulocito humano modificado por PEG producido por Amgen Inc. (PEG-filgrastim, Neulasta) fue también aprobado por FDA, que se usa para tratar cáncer de mama metastásico (pegfamg013102LB, http://www.fda.gov) . El FDA también aceptó la aplicación para antagonista de factor de crecimiento humano pegilado

desarrollado por Pharmacia. El fragmento de anticuerpo TNF-a combinado PEG de Celltech y el receptor PEG-TNF de Amgen se evalúan en los ensayos clínicos avanzados. La primera molécula PEG-orgánica conjugada, camptotecina pegilada, también entró en fase II de prueba clínica. En 2004, el oligonucleótido modificado por PEG (Pegaptanib, Macugen™) fue aprobado por FDA. El metabolismo in vivo del PEG en el fármaco (o PEG en sí mismo) ha sido entendido claramente, y PEG ha sido probado para ser un fármaco modificador bueno y seguro sin ningún efecto adverso.

Generalmente, una molécula de PEG modifica una proteína uniéndose al N-terminal de un grupo a-amino o Eamino de un residuo de Lys interno en la molécula de proteína. Hay normalmente tres tipos de PEG para modificación de proteína: una molécula de cadena lineal (EP 0593868) , una molécula ramificada con forma de U (EP 0809996) y una molécula ramificada con forma de Y (CN1243779C) . Hasta la fecha, no hay todavía ninguno de los informes sobre la preparación de ramificado con forma de Y de IFN-a2a modificado por PEG y la separación de diferentes IFN-a2a con una única modificación de molécula de PEG en posiciones de aminoácido diferentes. Se informó que la proteína ramificada PEG-modificada mostró mejor pH tolerancia, termo-estabilidad y resistencia contra la proteólisis que proteínas PEG-modificadas de cadena lineal (Monfardini et al. Bioconjugate Chem., 6, 62, 1995) .

Los PEG que se pueden unir a un fármaco de proteína normalmente necesitan ser derivatizados, de modo que uno o dos grupos terminales de los extremos de PEG pueden ser activados químicamente para poseer un grupo funcional apropiado que muestra actividad, y así pueden formar un enlace covalente estable con al menos un grupo funcional del fármaco con el que va a unirse. Por ejemplo, PEG se pueden unir a E-NH2 de un residuo de Lys en la cadena de péptido de proteína, o a a-NH2 del residuo de aminoácido N-terminal de la cadena de péptido de proteína. En la PEGilación de IFN-a descrita en la patente europea EP0809996, PEG-NHS se une a través de sustitución nucleofílica aa-NH2 del aminoácido N-terminal o E-NH2 de Lys en de IFN-a. El PEG-NHS mencionado en la patente anterior es un derivado de PEG ramificado con forma de U (PEG2-NHS) , la fórmula molecular de este es como sigue:

donde, R y R' son independientemente un grupo alquilo de peso molecular bajo, n y n' son de 600 a 1500, y el peso molecular medio de los PEG es de 26KD a 66KD. La fórmula molecular del IFN-a PEG2-NHS-modificado de como sigue:

Donde una o más moléculas PEG2-NHS se unen por a-NH2 del aminoácido N-terminal o E-NH2 de Lys en IFN-a, los productos obtenidos son una mezcla de IFN-a no pegilado, IFN-a pegilado en... [Seguir leyendo]

1. Interferón-a2a PEGilado (IFN-a2a) de la estructura de debajo, obtenido por enlace de IFN-a2a con un polietilenglicol ramificado con forma de Y (YPEG) :

donde, Pa y Pb son polietilenglicol (PEG) iguales o diferentes;

j es un número entero entre 1-12; Ri es H, grupo alquilo C1-C12 sustituido o no sustituido, arilo sustituido, aralquilo, o heteroalquilo; y X1 y X2 son independientemente un grupo de unión, donde X1 es (CH2) n, y X2 es seleccionado del grupo que consiste en (CH2) n, (CH2) nOCO, (CH2) nNHCO, y (CH2) nCO, donde n es un número entero entre 1-10, donde el YPEG se une a IFN-a2a vía un enlace amido formado por la cadena lateral del grupo E-amino del residuo de Lys en IFN-a2a

correspondiente a la posición 134 en la SEC ID nº 1.

2. IFN-a2a PEGilado según la reivindicación 1, con la estructura de debajo.

donde R y R' son independientemente un grupo alquilo C1-C4, preferiblemente metilo; j es un número entero entre 1-12; m y m' indican el grado de polimerización y pueden ser cualquier número entero; m+m' es preferiblemente de 600 a 1500, y

el peso molecular medio total del YPEG es preferiblemente de aproximadamente 10000 a aproximadamente 60000 Dalton, de forma más preferida aproximadamente 40000 Dalton.

3. IFN-a2a PEGilado de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, donde el IFN-a2a es extraído de una fuente natural u

obtenido a través de biotecnología recombinante, preferiblemente con la secuencia de aminoácidos como se muestra en 30 la SEC ID nº 1, de forma más preferida es un IFN-a2a humano recombinante.

4. IFN-a2a PEGilado según la reivindicación 3, donde el IFN-a2a humano recombinante es sintetizado artificialmente o expresado de un sistema de expresión seleccionado del grupo que consiste en un sistema de expresión procariota tal como E. coli, un sistema de expresión de levadura eucariota tal como Pichia, un sistema de expresión de célula de

insecto o un sistema de expresión de célula mamífera tal como CHO.

5. IFN-a2a PEGilado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el YPEG es un YPEG de brazos iguales de peso molecular de 40000 Dalton.

6. Composición comprendiendo una cantidad farmacéuticamente eficaz del IFN-a2a PEGilado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. Composición según la reivindicación 6, comprendiendo además manitol, un aminoácido, cloruro sódico y acetato

sódico, donde el aminoácido es seleccionado preferiblemente del grupo que consiste en ácido aspártico, asparagina y 45 glicina.

8. Uso del IFN-a2a PEGilado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o composición según la reivindicación 6 o 7 en la preparación de un medicamento para tratamiento de una enfermedad en necesidad de tratamiento con IFN-a2a, donde la enfermedad es preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en infecciones víricas, por ejemplo, hepatitis B,

50 hepatitis C, hepatitis D y condiloma acuminado; tumores, por ejemplo, leucemia de células pilosas, leucemia de mieloide crónica, leucemia maligna no Hodgkin de grado bajo, linfólisis mediada por células, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, melanoma maligno, linfoma de células T cutáneas, papiloma laríngeo, carcinoma de célula renal metastático o recurrente; trastornos y enfermedades inflamatorios, por ejemplo, esclerosis múltiple, artritis, asma, fibrosis cística y enfermedad de pulmón intersticial, y trombocitemia relacionada con enfermedades mieloproliferativas.

9. Método para preparación y purificación del IFN-a2a PEGilado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que incluye las etapas:

(a) bajo una condición alcalina, preferiblemente a pH 9, 0, permitiendo a PEG ramificado con forma de Y de la siguiente fórmula reaccionar con IFN-a2a, y obtener IFN-a2a PEGilado;

donde R y R' son independientemente un grupo alquilo C1-C4, preferiblemente metilo; j es un número entero entre 1-12; m y m' indican el grado de polimerización y pueden ser cualquier número entero y m+m' es preferiblemente de 600 a 1500;

(b) captura de los productos reactivos obtenidos en la fase (a) con una resina de intercambio de aniones, preferiblemente Q Sepharose FF, y elución de los productos en un gradiente de anión, preferiblemente en un gradiente de ión cloruro, para obtener productos modificados;

(c) elución de los productos reactivos capturados en la fase (b) con una resina de intercambio de cationes,

preferiblemente SP Sepharose FF, en un gradiente de cationes, preferiblemente en un gradiente de iones 15 sodio, y luego recogida de cada pico separadamente:

(d) determinación de la actividad del producto de cada pico y selección del pico correspondiente al producto de reacción con la actividad más alta.

10. Método según la reivindicación 9, donde el YPEG tiene un peso molecular de 40 kD, y es preferiblemente un Y-PEG 20 de brazos iguales, y más preferiblemente la proporción molar de la reacción de YPEG y IFN-a2a es 1:2.