Proteína híbrida, en la que la proteína comprende:

a) una de las secuencias SEC.

ID. nº 2 o 4; o

b) una secuencia que tiene más del 70% de identidad de secuencia con una de las SEC. ID. nº 2 o 4.

Expresión heteróloga de proteínas de Neisseria

Campo técnico

La presente invención pertenecen al campo de la expresión de proteínas. En particular, se refiere a la expresión heteróloga de proteínas de Neisseria (p. ej., N. gonorrhoeae o, preferentemente, N. meningitidis) .

Antecedentes de la invención

Las solicitudes de patentes internacionales WO 99/24578, WO 99/36544, WO 99/57280 y WO 00/230 dan a conocer proteínas de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae. Estas proteínas se describen normalmente como expresándose en E. coli (es decir, la expresión heteróloga) como fusiones de GST en el terminal N o fusiones con etiqueta His en el terminal C, aunque también se dan a conocer otros sistemas de expresión, incluyendo la expresión en Neisseria natural.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un enfoque alternativo y mejorado para la expresión heteróloga de estas proteínas. Este enfoque afectará normalmente el nivel de expresión, la facilidad de purificación, la localización celular de expresión y/o las propiedades inmunológicas de la proteína expresada.

Divulgación de la invención

Nomenclatura en la presente memoria

Las convenciones de nomenclatura utilizadas en el documento WO 99/57280 se utilizan en la presente memoria (por ejemplo, 'm287', 'g287' y 'a287' etc.) .

Secuencias

La invención también proporciona una proteína o un ácido nucleico que tiene cualquiera de las secuencias establecidas en los siguientes ejemplos. También proporciona proteínas y ácido nucleico que tienen identidad de secuencia con éstos. El grado de 'identidad de secuencia' es preferentemente superior al 50% (p. ej. 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) .

La identidad está determinado preferentemente por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman, ejecutado en el programa MPSRCH (Oxford Molecular) , utilizando una búsqueda de hueco afín con penalización por hueco abierto = 12 y penalización por extensión del hueco = 1. Normalmente, 50% de identidad o más entre dos proteínas se considera que es una indicación de equivalencia funcional.

Además, la invención proporciona ácidos nucleicos que pueden hibridarse al ácido nucleico dado a conocer en los ejemplos, preferentemente en condiciones de "alta severidad" (p. ej. 65°C en una solución al 0, 5% de SDS, 0, 1xSSC) .

La invención también proporciona ácido nucleico que codifica proteínas según la invención.

También debe apreciarse que la invención proporciona ácido nucleico que comprende secuencias complementarias a las descritas anteriormente (p. ej. para complementaria o de sondeo) .

El ácido nucleico según la invención puede prepararse, desde luego, de muchas maneras (p. ej. por síntesis química, a partir de bancos genómicos o de ADNc, a partir del propio organismo, etc.) y pueden adoptar diversas formas (p. ej. monocatenario, bicatenario, vectores, sondas etc.) .

Además, la expresión "ácido nucleico" comprende ADN y ARN y también sus análogos, tales como los que contienen ejes centrales y también ácidos peptidonucleicos (APN) , etc.

Las proteínas preferidas para su utilización según la invención son las del serogrupo b cepa 2996 o cepa 394/98 (cepa de Nueva Zelanda) de N. meningitidis. Salvo indicación contraria, las proteínas mencionadas en la presente memoria son de la cepa 2996 de N.meningilidis. Se apreciará, sin embargo, que la invención no esté limitada en general por la cepa. Las referencias a una determinada proteína (p. ej. '287', '953', etc.) podrán adoptarse para incluir esa proteína de cualquier cepa.

Proteínas híbridas

En un enfoque para expresión heteróloga, las proteínas 287 y 953 se expresan como una sola proteína híbrida. Es preferible que no se utilice ningún socio en la fusión no neisseriana (p. ej. GST o poli-His) .

Esto ofrece dos ventajas. En primer lugar, una proteína que puede ser inestable o mal expresada por su cuenta puede ser asistida agregando a un acompañante híbrido adecuado que resuelve el problema. En segundo lugar, se simplifica la elaboración comercial, sólo necesitan emplearse una expresión y purificación para producir dos proteínas útiles por separado.

Las proteínas fusionadas en el híbrido puede unirse directamente, o pueden unirse a través de un péptido engarce,

p. ej. mediante un engarce de poliglicina (es decir, Gn en el que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) o mediante una secuencia corta de péptidos que facilita la clonación. Evidentemente es preferible que una proteína ºG no se una al terminal C de un engarce de poli-glicina.

Las proteínas fusionadas pueden carecer de péptidos naturales principales o puede incluir la secuencia de péptidos principal del socio en la fusión del terminal N.

El procedimiento es muy adecuado para la expresión de las proteínas 287 y 953.

Las proteínas 287 y 953 pueden utilizarse en su forma esencialmente completa, o pueden utilizarse formas de eliminaciones (ºG) de poli-glicina (por ejemplo, ºG-287, etc.) o pueden utilizarse formas truncadas (p. ej. º1-287, º2-287 etc.) o pueden utilizarse versiones con dominio eliminado (p. ej. 287B, 287 C, 287BC, etc.) .

La 287 es preferentemente al final del terminal C de un híbrido; si ha de utilizarse en el terminal N, se prefiere utilizar una forma ºG de 287 (p. ej. como el terminal N de un híbrido con 953) .

La 287 es preferentemente de la cepa 2996 o de la cepa 394/98.

Las alineaciones de formas polimórficas de 287 y 953 se dan a conocer en el documento WO 00/66741. Cualquiera de estos polimorfos puede utilizarse según la presente invención.

Hospedador heterólogo

Mientras que la expresión de las proteínas de la invención puede tener lugar en el hospedador natural (es decir, el organismo en el que se expresa la proteína en la naturaleza) , la presente invención utiliza un hospedador heterólogo. El hospedador heterólogo puede ser procariota o eucariota. Preferentemente es E. coli, pero otros hospedadores adecuados incluyen Bacillus subtilis, Vibrio cholerae. Salmonella typhi, Salmonenna typhimurium, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria lactamica, Neisseria einerea, Mycobateria (p. ej., M. tuberculosis) , levadura, etc.

Vectores, etc.

Así como los métodos descritos anteriormente, la invención proporciona (a) ácido nucleico y vectores útiles en estos

procedimientos (b) los hospedadores que contienen dichos vectores (c) proteínas expresadas o expresables por los procedimientos (d) composiciones que comprenden estas proteínas, que puede ser adecuados como vacunas, por ejemplo, reactivos de diagnóstico o como como composiciones inmunógenas (e) estas composiciones para su utilización como medicamentos (p. ej. como vacunas) o como reactivos para diagnóstico (f) la utilización de estas composiciones en la preparación de (1) un medicamento para tratar o prevenir la infección debida a bacterias de Neisseria (2) un reactivo para diagnóstico destinado a detectar la presencia de bacterias de Neisseria o de anticuerpos aumentados contra bacterias Neisseria, y/o (3) un reactivo que puede aumentar los anticuerpos contra las bacterias Neisseria y (g) un método de tratamiento de un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de estas composiciones.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra dos proteínas híbridas según la invención.

Modos de realizar la invención

Ejemplo 1 - proteína 287

La proteína 287 de N. meningitidis (serogrupo B, cepa 2996) tiene la siguiente secuencia:

El péptido principal aparece subrayado. Las secuencias de 287 de otras cepas pueden encontrarse en las figuras 5 y 15 del documento WO 00/66741. El ejemplo 9 del documento WO 99/57280 da a conocer la expresión de 287 como una fusión de GST en E. coli. Se han utilizado numerosos enfoques más para expresar 287 en E. coli, incluyendo:

1) 287 como una fusión con etiqueta His ('287-His') ; 2) 287 con su propio péptido principal pero sin ningún socio en la fusión ('287 L') ; 3) 287 con el péptido principal... [Seguir leyendo]

1. Proteína híbrida, en la que la proteína comprende:

a) una de las secuencias SEC. ID. nº 2 o 4; o b) una secuencia que tiene más del 70% de identidad de secuencia con una de las SEC. ID. nº 2 o 4.

5 2. Proteína híbrida según la reivindicación 1, en la que la proteína comprende una secuencia que tiene 80% de identidad de secuencia con una de las SEC. ID. nº 2 o 4.

3. Proteína híbrida según la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína comprende una secuencia que tiene 90% de identidad de secuencia con una de las SEC. ID. nº 2 o 4.

4. Ácido nucleico que codifica la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

10 5. Vector que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 4.

6. Célula hospedadora que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 4 o el vector de la reivindicación 5.

7. Composición de diagnóstico o inmunógena que comprende la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. Proteína de la reivindicación 1 o composición de la reivindicación 7 para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de infección debida a bacterias neisserianas.

15 9. Procedimiento de expresión de una proteína híbrida, en el que la proteína comprende:

a) una de las secuencias SEC. ID. nº 2 o 4; o b) una secuencia que tiene más del 70% de identidad de secuencia con una de las SEC. ID. nº 2 o 4.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la proteína comprende una secuencia que tiene 80% de identidad de secuencia con una de las SEC. ID. nº 2 o 4.

11. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la proteína comprende una secuencia que tiene 90% de identidad de secuencia con una de las SEC. ID. nº 2 o 4.