Antígenos Neisseriales conservados.

Una proteína que comprende un fragmento de una proteína de Neisseria,

la proteína de Neisseria tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SECs ID Nº 1 a 6, en la que dicho fragmento comprende una región antigénica de la proteína de Neisseria y consiste en 7 o más aminoácidos conservados consecutivos, en la que los aminoácidos conservados se encuentran en al menos el 50 % o más de las SECs ID Nº 1 a 6, con la condición de que dicha proteína no es una proteína completa de Neisseria que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SECs ID Nº 1 a 41.

Campo de la invención La presente invención se refiere a antígenos de bacterias del género Neisseria conservados.

Antecedentes de la técnica Las bacterias Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae son diplococos gram negativos, inmóviles, que son patógenos en seres humanos.

Basándose en el polisacárido capsular del organismo, se han identificado 12 serogrupos de N. meningitidis. El grupo A es el patógeno más frecuentemente implicado en enfermedades epidémicas en el Ã?frica subsahariano. Los serogrupos B y C son los responsables de la inmensa mayoría de los casos en los Estados Unidos y en países más desarrollados. Los serogrupos W135 e Y son responsables del resto de los casos en los Estados Unidos y en países desarrollados.

La vacuna meningocócica actualmente en uso es una vacuna polisacárida tetravalente compuesta por los serogrupos A, C, Y y W135. Sin embargo, esta estrategia no puede usarse para el Meningoco B, porque el polisacárido capsular del menB es un polímero de ácido N-acetil neuramínico unido a α (2-8) que está también presente en el tejido de mamíferos. Una estrategia de una vacuna para el menB utiliza mezclas de proteínas de membrana externa (PME) . Para superar la variabilidad antigénica, se han construido vacunas multivalentes que contienen hasta nueve porinas diferentes [por ejemplo, Poolman (1992) Development of a meningococcal vaccine. Infect. Agents Dis. 4: 13-28]. Otras proteínas utilizadas en vacunas de membrana externa han sido las proteínas opa y opc, pero ninguna de estas estrategias han podido superar la variabilidad antigénica [por ejemplo, Ala’Aldeen y Borriello (1996) The meningococcal transferrin-binding proteins 1 and 2 are both surface exposed and generate bactericidal antibodies capable of killing homologous and heterologous strains. Vaccine 14 (1) : 49-53].

En los documentos WO99/24578, WO99/36544, WO99/57280 y WO00/22430 se desvela una gran cantidad de proteínas y secuencias de nucleótidos de Neisseria. Tettelin y col. en [Science (2000) 287: 1809-1815] desvelan datos exhaustivos de secuencias de la cepa MC58.

Descripción de la invención Para garantizar un reconocimiento y una reactividad máximos de cepas cruzadas, pueden usarse regiones de proteínas que están conservadas entre diferentes especies, serogrupos y cepas de Neisseria. Por lo tanto, la invención proporciona proteínas que comprenden tramos de secuencias de aminoácidos compartidos en la mayor parte del género Neisseria, particularmente en N. meningitidis y N. gonorrhoeae.

La invención presenta una proteína que comprende un fragmento de una proteína de Neisseria según se define en las reivindicaciones.

El fragmento comprende una región antigénica o inmunogénica de la proteína de Neisseria.

Un aminoácido “conservado” es un aminoácido que, en una proteína de Neisseria concreta, está presente al menos en un x % de Neisseria. El valor de x puede ser de 50% o mayor, por ejemplo de 66%, 75%, 80%, 90%, 95% o incluso de 100% (es decir, el aminoácido se encuentra en la proteína en cuestión en todo el género Neisseria) .

Para determinar si un aminoácido está “conservado” en una proteína Neisserial concreta, es necesario comparar este resto de aminoácido en las secuencias de la proteína en cuestión a partir de una pluralidad de diferentes especies de Neisseria (una “población de referencia”) . La población de referencia puede incluir diversas especies de Neisseria diferentes (preferentemente N. meningitidis y N.gonorrhoeae) o puede incluir una sola especie. La población de referencia puede incluir diversos serogrupos diferentes de una especie concreta (tales como los serogrupos A, B, C, W135, X, Y, Z y 29E de N. meningitidis) o un solo serogrupo. La población de referencia también puede incluir diversas cepas diferentes de un serogrupo concreto (tales como las cepas NG6/88, BZ198, NG3/88, 297-0, BZ147, BZ169, 528, BZ133, NGE31, NGH38, NGH15, BZ232, BZ83 y 44/76 de N. meningitidis B) . Una población de referencia preferida consta de las 5 cepas más comunes de N. meningitidis y/o de las 5 cepas más comunes de N. gonorrhoeae.

La población de referencia comprende preferentemente cepas k extraídas de diferentes ramas k de un árbol filogenético adecuado, tales como los descritos en (a) Ni y col. (1992) Epidemiol Infect 109: 227-239 (b) Wolff y col. (1992) Nucleic Acids Res 20: 4657 (c) Bygraves y Maiden (1992) J. Gen. Microbiol. 138: 523-531 (d) Caugant y col. (1987) J. Bacteriol. 69: 2781-2792. Otro árbol filogenético que puede usarse se muestra en la Figuras 8 y 9b del presente documento. Otro árbol filogenético que puede utilizarse se muestra en la Figura 2 del presente documento,

y otro en la Figura 4.

Se apreciará que, en la población de referencia, sólo se incluirá una especie, serogrupo o cepa concretos, si ésta codifica la proteína en la cual se localiza el aminoácido en cuestión. En el caso de aminoácidos incluidos en la ORF40, descrita más adelante, la población de referencia no debe incluir N. gonorrhoeae porque esta especie no contiene la ORF40.

Para proteínas solo encontradas en N. meningitidis, una población de referencia preferida comprende:

• N. meningitidis A, cepa Z2491

• N. meningitidis B, cepa NG6/88

• N. meningitidis W, cepa A22

¢N. gonorrhoeae, cepa Ng F62

Estas se describen en (a) Seiler A. et al. (1996) Mol. Microbiol. 19 (4) : 841 -856 (b) Maiden et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3140 -3145 (c) Virji et al. (1992) Mol. Microbiol. 6: 1271 -1279 (d) Dempsey et al. (1991) J. Bacteriol. 173: 5476 -5486.

Sin embargo, para las proteínas encontradas únicamente en N. meningitidis, una población de referencia preferente comprende:

• N.meningitidis A, cepa Z2491

• N.meningitidis B, cepas NG6 / 88

• N.meningitidis W, cepas A22

Las secuencias de aminoácidos de diferentes Neissierias pueden compararse fácilmente usando ordenadores. Típicamente esto implicará el alineamiento de diversas secuencias usando un algoritmo tal como CLUSTAL [Thompson y col. (1994) Nucleic “Acids Res 22: 4673=4680; Trends Biochem Sci (1998) 23: 403-405] o, preferentemente, PILEUP [parte del paquete informático GCG de Wisconsin, preferentemente la versión 9.0].

Los aminoácidos conservados se aprecian fácilmente en un alineamiento de secuencias múltiple -en la posición del aminoácido en cuestión un gran parte de las secuencias alineadas contendrán el aminoácido en particular. Los aminoácidos conservados pueden apreciarse más visualmente usando un programa tal como BOXSHADE [disponible, por ejemplo, on-line en el NIH], PRETYBOX [GCG] Wisconsin, versión 10] o JALVIEW [disponible online en el EBI].

La invención presenta también una proteína que comprende una de las secuencias que se muestran en las Figuras.

Preferentemente, la proteína comprende un fragmento de una de las proteínas desveladas en los documentos WO99/24578, WO99/36544, WO99/57280 o WO00/22430, o un fragmento de una de las 2158 ORF desveladas por Tettelin y col. en [Science (2000) 287:1809-1815]. Más particularmente, la proteína comprende preferentemente un fragmento de la ORF40. La proteína de la invención no comprenderá ninguna secuencia de las proteínas explícitamente desveladas en los documentos WO99/24578, WO99/36544, WO99/57280, WO00/22430 o por Tettelin y col.

La invención también proporciona una proteína que comprende una de las secuencias mostradas en las Figuras.

Las proteínas de la invención pueden prepararse, por supuesto, mediante diversos medios (por ejemplo, por expresión recombinante, expresión natural, purificación a partir de cultivo celular, síntesis química, etc.) y en diversas formas (por ejemplo, natural, fusiones, etc.) . Preferentemente, se preparan de una forma sustancialmente pura (es decir, sustancialmente libre de otras proteínas Neisseriales o células huésped) .

También se desvelan anticuerpos que se unen a estas proteínas. Éstos pueden ser policlonales o monoclonales y pueden producirse mediante cualquier medio adecuado.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención proporciona ácido nucleico que codifica las proteínas de la invención. También debe apreciarse que la invención proporciona ácidos nucleicos que comprenden secuencias complementarias a éstos (por ejemplo para fines antisentido o exploración) .

Adicionalmente, la invención proporciona ácido nucleico que puede hibridarse con el ácido nucleico de N. meningitidis desvelado en los ejemplos, preferentemente en condiciones de “alta rigurosidad” (por ejemplo 65 º C en una solución... [Seguir leyendo]

1. Una proteína que comprende un fragmento de una proteína de Neisseria, la proteína de Neisseria tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SECs ID Nº 1 a 6, en la que dicho fragmento comprende una región antigénica de la proteína de Neisseria y consiste en 7 o más aminoácidos conservados consecutivos, en la que los aminoácidos conservados se encuentran en al menos el 50 % o más de las SECs ID Nº 1 a 6, con la condición de que dicha proteína no es una proteína completa de Neisseria que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SECs ID Nº 1 a 41.

2. Una proteína según la reivindicación 1, en la que los aminoácidos conservados se encuentran en al menos el 50% omás delas SECs IDNº 1 a 41.

3. La proteína de la reivindicación 1, en la que dicho fragmento consiste en 20 o más aminoácidos conservados consecutivos.

4. Una proteína según la reivindicación 1, que comprende una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos: (a) MFKRSVIAMACI; (b) ALSACGGGGGGSPDVKSADT; (c) SKPAAPVV; (d) QDMAAVS; (e) ENTGNGGAATTD; (f) DGPSQNITLTHCK; (g) RRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGA EKL; (h) VQGEPAKGEMLAGTAVYNGEVLHFH; (i) GRFAAKVDFGSKSVDGIIDS GDDLHMG; (j) QKFKAAIDGNGFKGTWTENGGGDVSG (R / K) FYGPAGEEVAGK YSYRPTDAEKGGFGVFAGKKDRD.

5. Un ácido nucleico que codifica una proteína según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

6. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 5.

7. El vector de la reivindicación 6, que es un vector de expresión.

8. Una célula huésped transformada con el vector de las reivindicaciones 6 o 7.

9. Una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el ácido nucleico según la reivindicación 5, para su uso como medicamento.

10. El uso de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el ácido nucleico según la reivindicación 5, en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la infección debido a la bacteria Neisseria.

11. El uso de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el ácido nucleico según la reivindicación 5, en la fabricación de un reactivo de diagnóstico multiespecífico.

Figura 1 Figura 1 Cont. Figura 1 Cont. Figura 2

Figura 3

Posición de aminoácidos Figura 4 Figura 5 Figura 5 Cont. Figura 5 Cont. Figura 5 Cont. Figura 5 Cont. Figura 5 Cont. Figura 5 Cont. Figura 5 Cont. Figura 5 Cont.