ELISA rápido.

Un ensayo de unión para un analito en una muestra, que comprende las etapas de:

(i) mezclar en una fase homogénea, en un primer contenedor de reacción, la muestra y una primerapareja de unión marcada al analito para formar un primer producto de mezcla; y

(ii) transferir el primer producto de mezcla a un segundo contenedor de reacción y exponer el primerproducto de mezcla a una segunda pareja de unión al analito para formar un segundo producto demezcla.

ELISA rápido Campo de la técnica La presente invención pertenece al campo de los ensayos de inmunosorción ligada a enzimas (ELISA)

Técnica anterior

El ELISA es uno de los procedimientos más usados para la detección de y cuantificación de anticuerpos, antígenos, hormonas, citocinas, péptidos sintéticos y otras moléculas (Engvall E. 1980 Methods Enzymol. 70:419-39) .

Con mucha frecuencia, el ELISA se usa como procedimiento exclusivo no solo para detectar y cuantificar diversos ligandos, sino también para estudiar sus interacciones moleculares. De hecho, el ensayo es extremadamente popular tanto en la investigación como en la clínica debido a la capacidad de probar un gran número de muestras y porque no implica radiactividad. Al llevar a cabo el procedimiento, un ligando (normalmente en forma de un antígeno, anticuerpo o péptido) se coloca sobre la superficie de cada micropocillo en una microplaca de 96 pocillos y se mantiene ahí mediante enlaces no covalentes entre las regiones hidrofóbicas de la proteína y la superficie de plástico apolar. El área residual no recubierta de cada pocillo se bloquea después con una proteína o polímero inerte para prevenir cualquier unión inespecífica de los reactivos. A continuación, la correspondiente contramolécula se incuba con el ligando durante un periodo de varias horas. Después, se lava el pocillo y se añade un segundo anticuerpo conjugado con enzima, específico de la contramolécula, y se incuba durante aproximadamente 2 horas o más. Por último, se proporciona un sustrato para la enzima conjugada y la reacción se cuantifica midiendo cualquier cambio de color en el sustrato. La Figura 1 muestra las etapas en una prueba ELISA estándar para analizar los anticuerpos séricos.

El ELISA estándar a menudo implica velocidades de reacción lentas que requieren elevados tiempos de incubación en el intervalo de 1-3 horas. En la técnica existe la necesidad de un ELLISA de alto rendimiento que use tiempos de incubación más cortos y, por tanto, que se pueda completar en un periodo de tiempo más corto.

Divulgación de la invención La velocidad de una reacción con dos o más reactantes se controla mediante dos etapas: (a) la velocidad de difusión de los reactantes (caracterizada por la kdif.) y (b) la velocidad de la reacción química (caracterizada por la kquim.) . Cuando ambos reactantes son capaces de moverse con libertad, la reacción se denomina reacción de fase homogénea (es decir, una en la que al menos dos reactantes están en una fase fluida) y cuando un reactante está inmovilizado, la reacción se denomina reacción de fase heterogénea. Como uno de los componentes en una reacción de fase heterogénea tiene una kdif. de cero, la reacción tiene lugar a una velocidad menor que una reacción homogénea, en la que ambos reactantes tienen una kdif. elevada.

Todas las etapas de reacción en un ELISA estándar son reacciones de fase heterogénea, es decir un componente está en solución mientras que el otro está inmovilizado.

Los presentes inventores han encontrado, sorprendentemente, que cambiando una o más de las etapas en el ELISA de una reacción en fase heterogénea a una en fase homogénea se obtiene como resultado un tiempo de finalización global muchos más corto, lo que permite completar un ELISA en menos tiempo que el requerido para un ELISA conocido en la técnica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el cambio de una etapa a una reacción en fase homogénea permite la finalización en aproximadamente un 30 % del tiempo requerido para un ELISA conocido en la técnica. En otras realizaciones, el tiempo se puede reducir en aproximadamente, por ejemplo, 10 %, 20 %, 40 %, 50 % o 60 %. Además, cambiando una etapa a una fase homogénea se garantiza que cada unión de los complejos inmunitarios a los pocillos de la placa sea una unión eficaz en términos de desarrollo de señal, por tanto, el tiempo de incubación de la fase heterogénea se puede reducir espectacularmente o se usa un tiempo de incubación estándar para dar un incremento elevado de la amplificación de la señal. El procedimiento de ELISA corto confiere muchas ventajas sobre el ELISA estándar. Po ejemplo, la mayor velocidad de finalización del procedimiento de ELISA corto permite la simple y rápida detección de patógenos en un contexto clínico y, por tanto, permite entregar resultados a los pacientes y, en consecuencia, el tratamiento de los pacientes durante un periodo de tiempo más corto.

En algunas realizaciones del nuevo procedimiento de ELISA corto para anticuerpos, los anticuerpos séricos (analito) se mezclan con los anticuerpos marcados específicos de los anticuerpos séricos en un contenedor de reacción, por ejemplo un tubo de ensayo (fase homogénea) y se incuban durante 10 minutos o 5 minutos (Etapa 1) . Después, la mezcla de productos se transfiere a un pocillo de microtitulación revestido con un antígeno y se incuba durante 10 minutos o 10-15 minutos (etapa 2) . El micropocillo se lava y se añade un reactivo de color y se desarrolla durante 30 minutos o 10 minutos (etapa 3) . Una etapa de lavado final puede preceder a medir la absorbancia a una longitud de onda específica del reactivo de color. Por tanto, el analito y el marcador se mezclan previamente en una fase homogénea antes de juntarse con la pareja de unión inmovilizada para el analito (es decir, el anticuerpo sérico en este ejemplo) . La Figura 2 proporciona una representación gráfica de una realización del procedimiento de ELISA corto de la presente solicitud para analizar los anticuerpos séricos como el analito. Si el analito es un antígeno, el contenedor de la segunda reacción se reviste con un anticuerpo frente al antígeno.

De acuerdo con esto, la invención proporciona un ensayo de unión para detectar un analito en una muestra, que comprende las etapas de (i) mezclar en una fase homogénea la muestra y una primera pareja de unión al analito para formar un primer producto de mezcla y (ii) exponer el primer producto de mezcla a una segunda pareja de unión al analito. Preferentemente, la primera pareja de unión está marcada.

Normalmente, la segunda pareja de unión está inmovilizada de modo que la etapa (iii) se produce en la fase heterogénea. Por ejemplo, la etapa (i) se puede llevar a cabo en un primer contenedor de reacción y la etapa (ii) en un segundo contenedor de reacción en el que la segunda pareja de unión está inmovilizada sobre la superficie del segundo contenedor de reacción.

Por tanto, la invención proporciona un ensayo de unión para detectar un analito en una muestra, que comprende las etapas de (i) mezclar en una fase homogénea, en un primer contenedor de reacción, la muestra y una primera pareja de unión al analito para formar un primer producto de mezcla; (ii) transferir el primer producto de mezcla a un segundo contenedor de reacción; y (iii) mezclar en el segundo contenedor de reacción el primer producto de mezcla y una segunda pareja de unión al analito. Preferentemente, la primera pareja de unión está marcada.

Etapa (i)

La etapa (i) del procedimiento de ELISA corto implica mezclar, en una fase homogénea, la muestra que se va a analizar con respecto a un analito y una primera pareja de unión al analito para formar un primer producto de mezcla. Esta etapa tiene lugar en un primer contenedor de reacción.

Una muestra puede contener, o sospecharse que contiene, uno o más analitos destinados a la detección mediante el procedimiento de ELISA corto. Incluso si no hay analito, el ensayo sigue siendo “para detectar” el analito. Por ejemplo, el ensayo se puede realizar en una muestra control negativo para confirmar la fidelidad del ensayo. Como ejemplo adicional, si el procedimiento de ELISA corto se usa para detectar la presencia o ausencia de anticuerpos séricos frente a un patógeno en un paciente, el primer producto de mezcla de la etapa (i) puede ser un complejo inmunitario, en el caso de un paciente infectado, o se puede definir por la ausencia de un complejo inmunitario en un paciente no infectado.

La elección de la pareja de unión usada en la etapa (i) dependerá del analito. Por ejemplo, cuando el analito es un anticuerpo sérico, la primera pareja de unión puede ser un anticuerpo marcado específicamente dirigido al anticuerpo sérico, por ejemplo a su cadena pesada, y la segunda pareja de unión puede ser un polipéptido que contiene un epítopo reconocido por el anticuerpo sérico. En un segundo ejemplo, el analito puede ser un polipéptido que contiene un primer epítopo reconocido por la primera pareja de unión, un anticuerpo marcado, y la segunda pareja de unión puede ser un anticuerpo que reconoce un segundo epítopo en el polipéptido. En ciertas realizaciones, la segunda... [Seguir leyendo]

1. Un ensayo de unión para un analito en una muestra, que comprende las etapas de:

(i) mezclar en una fase homogénea, en un primer contenedor de reacción, la muestra y una primera pareja de unión marcada al analito para formar un primer producto de mezcla; y

(ii) transferir el primer producto de mezcla a un segundo contenedor de reacción y exponer el primer producto de mezcla a una segunda pareja de unión al analito para formar un segundo producto de mezcla.

2. El ensayo de unión de la reivindicación 1, en el que la primera pareja de unión está conjugada a una enzima.

3. El ensayo de unión de la reivindicación 1, en el que la primera pareja de unión está conjugada a un marcador directo.

4. El ensayo de unión de cualquier reivindicación precedente, en el que la primera pareja de unión es un anticuerpo.

5. El ensayo de unión de la reivindicación 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo IgG.

6. El ensayo de unión de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en el que el anticuerpo se usa a una dilución de

1:1.000.

7. El ensayo de unión de cualquier reivindicación precedente, en el que el analito es un anticuerpo.

8. El ensayo de unión de la reivindicación 7, en el que el anticuerpo es un anticuerpo IgG.

9. El ensayo de unión de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que el anticuerpo es un anticuerpo sérico.

10. El ensayo de unión de la reivindicación 9, en el que el anticuerpo sérico se usa a una dilución de 1:6.000.

11. El ensayo de unión de cualquier reivindicación precedente, en el que la etapa (i) se lleva a cabo durante 10 minutos o 5 minutos.

12. El ensayo de unión de cualquier reivindicación precedente, en el que la segunda pareja de unión está inmovilizada y la etapa (ii) se produce en la fase heterogénea.

13. El ensayo de unión de cualquier reivindicación precedente, en el que la etapa (ii) se lleva a cabo durante 10 minutos o 10 – 15 minutos.

14. El ensayo de unión de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende detectar dicho segundo producto de mezcla.

15. El ensayo de unión de la reivindicación 14, en el que la detección implica un cambio de color en un reactante.

16. El ensayo de unión de la reivindicación 15, en el que el reactante es p-nitrofenilfosfato.

17. El ensayo de unión de la reivindicación 16, en el que el p-nitrofenilfosfato está a una concentración de 3, 0 mg/ml.

18. El ensayo de unión de cualquier reivindicación precedente, en el que el ensayo se realiza en un tiempo total inferior a 4 horas.