Variantes múltiples de proteína NMB 1870 de meningococo.

Una composición inmunogénica que comprende: (i) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:

42 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos consistente de un fragmento de al menos 80 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 42, caracterizada porque la proteína es una lipoproteína; y (ii) un adyuvante de sal de aluminio.

Variantes múltiples de proteína NMB 1870 de meningococo.

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN 5

La presente invención se encuentra en el campo de la vacunación y, en particular, en la vacunación contra enfermedades causada por bacterias patógenas del género Neisseria tales que N.meningitidis (meningococos) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 10

Neisseria meningitidis es una bacteria encapsulada gram negativa que coloniza el tracto respiratorio superior de, aproximadamente, el 10 % de la población. Aproximadamente, en una de cada 10.000 personas colonizadas (o una de 100.000) la bacteria se introduce en el torrente sanguíneo, donde se multiplica y causa sepsis. Desde el torrente sanguíneo, la bacteria puede atravesarla barrera hematocefálica y causar meningitis. Ambas enfermedades son 15 devastadoras y pueden matar del 5 % al 15 % de los niños y jóvenes adultos en horas, a pesar de que existen antibióticos efectivos. Más del 25 % de los que sobreviven a la enfermedad sufren secuelas permanentes.

La prevención de la enfermedad se ha conseguido parcialmente gracias a la vacunación. La inmunización se hizo posible en 1969 cuando se descubrió que la protección de la enfermedad está relacionada con la presencia de 20 anticuerpos del suero capaces de inducir la destrucción bacteriana mediada por complemento y que los polisacáridos capsulares conjugados eran capaces de inducir estos anticuerpos. Aunque existen vacunas de polisacáridos y las vacunas conjugadas contra los serotipos A, C, W135 e Y, este enfoque no puede aplicarse al serotipo B ya que el polisacárido capsular es un polímero de ácido polisiálico, un autoantígeno en humanos. Para desarrollar una vacuna contra el serotipo B se han utilizado las proteínas expuestas en la superficie de vesículas de 25 la membrana externa. Estas vacunas provocaron respuestas de anticuerpos bactericidas en el suero y protegían de la enfermedad, pero no inducían protección cruzada de cepas [1].

La secuencia genómica completa del serotipo B N. meningitidis ya se ha publicado [2] y ha sido sujeto de análisis para identificar antígenos de la vacuna [3]. También se conoce la secuencia genómica completa del serotipo A N. 30 meningitidis [4], y la secuencia genómica completa de la cepa FA1090 de Neisseria gonorrhoeae se encuentra disponible [5]. Las referencias de la 6 a la 9 describen proteínas de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae, y se describen enfoques de la expresión a estas proteínas en las referencias 10 a 12.

Es objeto de la presente invención proporcionar y mejorar composiciones que otorguen inmunidad contra 35 enfermedades y / o infecciones por meningococos, en particular para el serotipo B.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Una de las, aproximadamente, 2.200 proteínas descritas en la referencia 2 es “NMB1870”. En un principio, la 40 proteína se describió como proteína “741” de la cepa MC58 (SECs ID Nº 2535 y 2536 de la referencia 8M SEC ID Nº 1) y también se ha nombrado como “GNA1870” [referencia 3] o como “ORF2086” [13].

La referencia 13 describe diversas secuencias de NMB1870 y las divide en subfamilias “A” y “B”. Estas subfamilias pueden combinarse. La referencia 13 no describe combinaciones adyuvantes con una sal de aluminio y no describe 45 la unión de las subfamilias A y B como una proteína de fusión.

Se ha descubierto que NMB1870 es un antígeno extremadamente efectivo para provocar respuestas de anticuerpos frente al meningococo y que es expresado por todos los serotipos meningococo. Se ha encontrado NMB1870 en todas las cepas meningocócicas probadas hasta la fecha. Se han identificado cuarenta y dos secuencias 50 meningocócicas diferentes de NMB1870, y se ha descubierto que esas secuencias se agrupan en tres variantes. Además, se ha descubierto que el suero producido contra una variante dada es bactericida dentro del mismo grupo de variante, pero no es activo contra cepas que expresen una de las otras dos variantes, es decir, hay protección cruzada dentro de las variantes pero no entre variantes. Por lo tanto, para una mayor eficacia cruzada de las cepas, debería utilizarse más de una variante para inmunizar un paciente. 55

La invención presenta por lo tanto uhna composición como se define en las reivindicaciones.

Las respuestas anticuerpo bactericidas se han medido convenientemente en ratones y son un indicador estándar de la eficacia de la vacuna [véase, por ejemplo, la nota final de la referencia 3]. La composición no necesita inducir 60 anticuerpos bactericidas frente a todas y cada una de las cepas MenB en las razas especificadas o MLST; más bien, para cualquier grupo dado de cuatro o más cepas del serotipo B meningococos en una raza hipervirulenta en particular o un MLST, los anticuerpos inducidos por la composición son bactericidas frente a, al menos, el 50 % (por ejemplo el 60 %, 70%, 80 %, 90 % o más) del grupo. En la forma preferente, los grupos de cepas incluirán cepas aisladas en, al menos, cuatro de los siguientes países: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, BR y CU. Preferiblemente, 65 el suero tiene un título bactericida de, al menos, 1024 (por ejemplo 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 o superior,

preferiblemente de, al menos, 214) , es decir, el suero es capaz de matar al menos al 50 % de la bacteria de prueba de una cepa en particular cuando se diluye 1 / 1024, por ejemplo, como se describe en la nota final 14 de la referencia 3.

Lipoproteínas 5

NMB1870 es una lipoproteína natural de N. meningitidis. También se ha descubierto lipidada cuando se expresa en E. coli.

Una proteína NMB1870 incluida en las composiciones de la invención es una lipoproteína. 10

En la forma preferente, la lipoproteína tiene un residuo de cisteína N – Terminal al que se une el lípido covalentemente. Preparar la lipoproteína mediante expresión bacteriana requiere, por lo general, una señal peptídica N – Terminal apta para dirigir la lipidación mediante transferasa diacilgliceril, seguida del corte por una SPasa específica de la lipoproteína (tipo II) . Mientras que la lipoproteína de la invención pueden tener una cisteína N – 15 Terminal, por lo tanto, será un producto de modificación post-translacional de una proteína naciente que tenga la metionina N – Terminal corriente.

La lipoproteína puede asociarse con una bicapa lipídica y solubilizarse con detergente.

Una característica de las proteínas preferidas de la invención es la habilidad para inducir anticuerpos bactericidas frente al meningococo tras su administración a un animal huésped.

Las proteínas se pueden preparar mediante diversos medios como, por ejemplo, la síntesis química (al menos en parte) , la digestión de polipéptidos largos mediante proteasas, la traducción a partir de ARN, la purificación a partir 25 de cultivos celulares (por ejemplo a partir de expresión recombinante o de cultivos de N. meningitidis) , etc. La expresión heteróloga en un huésped de E. coli es la ruta de expresión preferida (por ejemplo, las cepas DH5α, BL21 (DE3) , BLR, etc.) .

Las proteínas de la invención pueden estar unidas a o inmobilizadas en un soporte sólido.

Las proteínas de la invención pueden comprender una marca detectable como, por ejemplo, una marca radioactiva, 30 fluorescente o de biotina. Esto resulta particularmente práctico en las técnicas de inmunoensayo.

Las proteínas pueden tomar diversas formas ( por ejemplo nativas, de fusión, glicosiladas, no glicosiladas, lipídicas, puentes disulfuro, etc) . En la forma preferente las proteínas son proteínas meningocócicas.

En la forma preferente, las proteínas se preparan de forma sustancialmente pura o sustancialmente aislada (es decir, sustancialmente libre de otros Neisseria o proteínas celulares del huésped) o de forma sustancialmente aislada. En general, las proteínas se proporcionan en un medio no natural, por ejemplo, se separan de sus medio natural. En ciertas realizaciones, la proteína sujeto está presente en una composición enriquecida para la proteína en comparación al control. Por definición, la proteína purificada se presenta a través de la cual purificado significa 40 que la proteína se presenta en una composición sustancialmente libre de otras proteínas expresadas, en la que sustancialmente significa que menos del 90 %, normalmente menos del 60 % y más normalmente menos del 50 % de la composición está realizada de otras proteínas expresadas.

El término “proteína” aquí utilizado se refiere a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede 45 ser lineal o ramificado, pueden... [Seguir leyendo]

1. Una composición inmunogénica que comprende: (i) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 42 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos consistente de un fragmento de al menos 80 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 5 42, caracterizada porque la proteína es una lipoproteína; y (ii) un adyuvante de sal de aluminio.

2. La composición según la reivindicación 1, en la que el adyuvante de sal de aluminio es un adyuvante de fosfato de aluminio.

3. La composición según la reivindicación 2, en la que el adyuvante de fosfato de aluminio es un adyuvante de hidroxifosfato de aluminio.

4. La composición según la reivindicación 1, en la que el adyuvante de sal de aluminio es un adyuvante de hidróxido de aluminio. 15

5. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proteína de (i) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 96% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 42.

6. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proteína de (i) comprende 20 una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 42.

7. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un antígeno de Neisseria distinto a una proteína NMB 1870.

8. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende: (i) un antígeno sacárido del serogrupo A, C, W135 y/o Y de la N.meningitidis; y/o (ii) un antígeno sacárido de la Haemophilus influenzae Tipo B; en la que el (los) antígeno (s) sacárido (s) y/o (ii) es/están conjugados con una o más proteínas portadoras.

9. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso como un medicamento.

NÚMERO DE CÉLULAS BACTERIANAS