Vesículas bacterianas inmunogénicas con proteínas de membrana externa.

Una bacteria de Escherichia coli patógena, que no expresa una proteína del complejo Tol-Pal y/o que tiene una mutación de bloqueo de su gen mltA

Vesículas bacterianas inmunogénicas con proteínas de membrana externa.

CAMPO TECNICO 5

Esta invención está en el campo de la preparación de vesículas con propósitos de inmunización.

ANTECEDENTES DE LA TECNICA

Uno de los varios enfoques para inmunizar contra la infección por N.meningitidis es usar vesículas de membrana externa (OMVs) . Una vacuna OMV eficaz contra el serogrupo B ha sido producida por el Norwegian National Institute of Public Health [por ejemplo, ref. 1] pero, aunque esta vacuna es segura y evita la enfermedad MenB, su eficacia está limitada a la cepa homóloga usada para hacer la vacuna.

La vacuna 'RIVM' está basada en OMVs que contienen seis subtipos de PorA diferentes. Ha demostrado ser inmunogénica en niños en ensayos clínicos de fase II [2].

La referencia 3 describe una vacuna contra diferentes serotipos patógenos del meningococo del serogrupo B basada en OMVs que conservan un complejo de proteínas de 65-kDa. La referencia 4 describe una vacuna que 20 comprende OMVs de cepas meningocócicas diseñadas genéticamente, con las OMVs que comprende: al menos una proteína de membrana externa (OMP) Clase 1 pero no comprende una OMP Clase 2/3. La referencia 5 describe OMVs que comprenden OMPs que tienen mutaciones en sus bucles de superficie y OMVs que comprenden derivados de lipopolisacárido meningocócico (LPS) .

Además de la N.meningitidis del serogrupo B, las vesículas han sido preparadas para otras bacterias. La referencia 6 describe un proceso para preparar vacunas basadas en OMV para el meningococo del serogrupo A. Las referencias 7 y 8describen vesículas de la N.gonorrhoeae. La referencia 9 describe preparaciones de vesículas par ala N.lactamica. Las vesículas han sido preparadas de Moraxella catarrhalis [10, 11], Shigella flexneri [12, 13], Pseudomonas aeruginosa [12, 13], Porphyromonas gingivalis [14], Treponema pallidum [15], Haemophilus influenzae 30 [16 & 21] y Helicobacter pylori [17].

El fallo de las OMVS para provocar una protección cruzada contra las cepas no homólogas no es bien entendido, particularmente ya que la mayoría de los aislados de N.meningitidis comparten un pequeño número de antígenos de superficie protectores conservados que, si están presentes en las OMVs, se esperaría que 35 proporcionasen cobertura protectora amplia. Una posible explicación para el fallo es la existencia de antígenos de superficie inmune-dominantes variables que evitan que los antígenos conservados ejerzan su acción protectora y la presencia de proteínas híper-variables inmune-dominantes como la PorA se ha documentado y demostrado extensamente. Otras posibles explicaciones son que los métodos para la preparación DEOMV resultan en la contaminación con proteínas citoplasmáticas y/o de la membrana interna que diluyen las proteínas de la membrana 40 externa protectoras, o que los antígenos se pierden por la extracción con detergente.

Ha habido varias propuestas para mejorar la eficacia de las OMV. La referencia 18 describe composiciones que comprenden OMVs suplementadas con proteínas de unión a transferrina (por ejemplo, TbpA y TbpB) y/o Cu, Zn superóxido dismutasa. La referencia 19 describe composiciones que comprenden OMVs suplementadas por varias 45 proteínas. La referencia 20 describe preparaciones de vesículas de membrana de N.meningitidis con un gen fur modificado. La referencia 21 enseña que la expresión de nspA debería ser sobre-regulada con bloqueos de porA y cps concomitantes. Mutantes bloqueados adicionales de la N.meningitidis para la producción de OMV se describen en las referencias 21 a 23. A diferencia de estos intentos de mejorar las OMVs cambiando los patrones de expresión, la referencia 24 se enfoca en cambiar los métodos para la preparación de OMV, y enseña que los 50 antígenos como el NspA pueden ser retenidos durante la extracción de vesículas evitando el uso de detergentes como el desoxicolato.

Es un objeto de la invención el proporcionar preparaciones de vesículas mejoradas y adicionales, junto con procesos para su fabricación. En particular, es un objeto de la invención el proporcionar vesículas que conserven 55 componentes inmunogénicos bacterianos importantes de la N.meningitidis.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La invención se basa en el descubrimiento sorprendente de que la interrupción en las vías implicadas en la 60 degradación del peptidoglicano (la capa murina) da la bacteria que libera vesículas en el medio de cultivo, y que estas vesículas son ricas en proteínas de la membrana externa inmunogénicas y pueden provocar respuestas inmunes bactericidas de amplio alcance. Las vesículas son diferentes de las OMVs que pueden ser preparadas interrumpiendo bacterias completas (por ejemplo, por sonicación y extracción de sarcosilo [25]) , y pueden ser preparadas sin interrumpir las células bacterianas, por ejemplo simplemente separando las vesículas de las 65

bacterias por un proceso como la centrifugación.

En particular, los inventores han descubierto que el bloqueo del homólogo mltA meningocócico (también referido como 'GNA33' o 'NMB0033' [26]) lleva a la liberación espontanea de vesículas que son ricas en proteínas de la membrana externa inmunogénicas y que pueden provocar respuestas de anticuerpos ampliamente de protección 5 cruzada con títulos bactericidas mayores que las OMVs preparadas por procesos de producción normales. Esta eficacia mejorada es sorprendente por dos razones: primero, se ha informado anteriormente que la proteína NMB0033 es altamente efectiva en el aumento de anticuerpos bactericidas (por ejemplo, ver la tabla 1 de la referencia 27) y que es un candidato de vacunas fuerte (ver por ejemplo l atabla 2 de la referencia 28) , con una recomendación en la referencia 29 que debería ser regulada para la producción de vesículas, de tal manera que se 10 esperaría que su pérdida a priori reduzca la eficacia bactericida en lugar de aumentarla; segundo, las cepas bloqueadas no tienen la organización topológica correcta de la membrana celular, y se ha informado previamente que las proteínas constituyentes principales de las OMVs normales (por ejemplo, la PorA, PIB, proteínas de membrana externa clase 4 y clase 5) son liberadas en el medio de cultivo [25]. Los inventores han descubierto ahora que la liberación informada anteriormente no implica la secreción de proteínas discretas, sino que en su lugar las 15 proteínas de la membrana externa son liberadas en forma de vesículas. Estas vesículas son ventajosas sobre las OVMs preparadas por medios del estado de la técnica ya que son liberadas espontáneamente en el medio de cultivo y pueden por lo tanto ser preparadas simplemente y eficientemente sin la interrupción complicada y que consume tiempo y los métodos de purificación que son normalmente usados para preparar OMVs.

Por lo tanto la invención proporciona una bacteria que tiene una mutación de bloqueo de su gen mltA. La bacteria preferiblemente tiene también una mutación de bloqueo de al menos un gen adicional, por ejemplo los genes porA y/o porB y/o IpxA.

La invención también proporciona una bacteria, en donde: (i) la bacteria tiene una pared celular que incluye 25 peptidoglicano; y (ii) la bacteria no expresa una proteína que tiene una actividad lítica transglicosilasa de la proteína MltA. La bacteria es preferiblemente una bacteria mutante, es decir, la bacteria es una cepa mutante de una especie del tipo salvaje que expresa la proteína MltA. La bacteria preferiblemente tampoco expresa al menos una proteína adicional, por ejemplo las proteínas porA y/o porB y/o LpxA.

La invención también proporciona una composición que comprende vesículas que, durante el cultivo de las bacterias de la invención, son liberadas en el medio de cultivo. Esta composición preferiblemente no comprende ninguna bacteria viva y/o completa. Esta composición puede ser usada para la preparación de vacunas.

La invención también proporciona una composición que comprende vesículas, en donde las vesículas están 35 presente en el filtrado obtenible después de la filtración a través de un filtro de 0, 22 μm de un medio de cultivo en el que se ha desarrollado una bacteria de la invención . Esta composición puede ser usada para la preparación de vacunas.

La invención también proporciona un proceso para preparar vesículas bacterianos, que comprende los 40 pasos de: (i) cultivar una bacteria MltA¯ en un medio de cultivo de tal forma que la bacteria libere vesículas en el mencionado medio; y (ii) recoger las vesículas de dicho medio. La bacteria MltA¯ es preferiblemente un mutante de bloqueo â MltA. Las vesículas pueden ser recogidas por separación por tamaño (por ejemplo filtración,... [Seguir leyendo]

1. Una bacteria de Escherichia coli patógena, que no expresa una proteína del complejo Tol-Pal y/o que tiene una mutación de bloqueo de su gen mltA.

2. La E.coli de la reivindicación 1, que es una cepa tolR.

3. Una bacteria en el género Escherichia, en donde (i) la bacteria tiene una pared celular que incluye peptidoglicano; y (ii) la bacteria no expresa una proteína que tiene una actividad de transglicosilasa lítica de la proteína MltA.

4. La bacteria de la reivindicación 3, que tiene también una mutación de bloqueo de al menos un gen adicional.

5. La bacteria de la reivindicación 3 o la reivindicación 4, que es una E.coli patógena.

6. La bacteria de la reivindicación 5, en donde la E.coli patógena es una bacteria patógena extraintestinal, una 15 bacteria uropatógena o una bacteria asociada a la meningitis/sepsis.

7. Una composición que comprende vesículas que, durante el cultivo de la bacteria de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, son liberadas en el medio de cultivo.

8. La composición de la reivindicación 7, en donde la composición no comprende ninguna bacteria viva y/o completa.

9. Una composición que comprende vesículas, en donde las vesículas están presentes en el filtrado obtenible después de la filtración a través de un filtro de 0, 22 μm de un medio de cultivo en el que se ha desarrollado una bacteria de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. 25

10. Una vesícula obtenible cultivando la bacteria de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

11. Una composición farmacéutica que comprende vesículas de la reivindicación 10.

12. Un proceso para preparar vesículas bacterianas, que comprende los pasos de: i) cultivar una bacteria de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un medio de cultivo de tal forma que la bacteria libere vesículas en el mencionado medio; y (ii) recoger las vesículas de dicho medio.