Dominios y epítopes de proteínas meningocócicas NMB 1870.

Un procedimiento para producir una secuencia de aminoácidos NMB1870 quimérica,

que comprende las etapasde: (a) alinear una primera secuencia de aminoácidos NMB1870 con una segunda secuencia de aminoácidosNMB1870, en la que la primera y segunda secuencias son diferentes y provienen de familias diferentes deNMB1870, para proporcionar un par de secuencias alineadas; (b) seleccionar una parte de la primera secuencia deaminoácidos, comenzando en el aminoácido a1 de dicha primera secuencia de aminoácidos y acabando en elaminoácido b1 de dicha primera secuencia de aminoácidos, en la que la parte es una secuencia de superficie enbucle; (c) seleccionar una parte de la segunda secuencia de aminoácidos, comenzando en el aminoácido a2 de dichasegunda secuencia de aminoácidos y acabando en el aminoácido b2 de dicha segunda secuencia de aminoácidos,en la que la parte es una secuencia de superficie en bucle y en la que los restos a1 y a2 así como b1 y b2 estánalineados en el par de secuencias alineadas; y (d) reemplazar dicha parte de la primera secuencia de aminoácidospor dicha parte de la segunda secuencia de aminoácidos, proporcionando así la secuencia de aminoácidosNMB1870 quimérica, en la que la secuencias de aminoácidos comprenden una secuencia estructural, en ochopartes y siete bucles de superficie, uno entre cada parte de la secuencia estructural.

Dominios y epítopes de proteínas meningocócicas NMB 1870

Campo técnico

La presente invención se encuentra en el campo de la inmunización y, en particular, inmunización contra enfermedades producidas por bacterias patógenas del género Neisseria, tales como N. meningitidis (meningococo) .

Técnica anterior

Neisseria meningitidis es una bacteria Gram-negativa encapsulada que coloniza el tracto respiratorio superior de aproximadamente el 10% de la población humana. Aunque se dispone de las vacunas de polisacáridos y conjugados contra los serogrupos A, C, W135 e Y, esta estrategia no puede aplicarse al serogrupo B porque el polisacárido capsular es un polímero de ácido polisiálico, que es un autoantígeno en seres humanos. Para desarrollar una vacuna contra el serogrupo B, se han usado proteínas expuestas en superficie contenidas en las vesículas de la membrana externa (VME) . Estas vacunas provocan respuestas de anticuerpos bactericidas en suero y protegen contra la enfermedad, pero no inducen protección cruzada entre cepas[1]. Algunos investigadores, por tanto, se han centrado en antígenos meningocócicos específicos para su uso en vacunas.

Uno de estos antígenos es ‘NMB1870’. Esta proteína se denominó inicialmente proteína ‘741’ de la cepa MC58 [SEC ID Nº 2535 y 2536 en la ref. 2; SEC ID 1 en el presente documento], y también se ha denominado ‘GNA1870’ [ref. 3, después de la referencia 4] y ‘ORF2086’ [5, 6]. Esta proteína se expresa en todos los serogrupos de meningococos y se ha encontrado en múltiples cepas de meningococos. Las secuencias de NMB1870 se han agrupado en tres familias, y se ha encontrado que el suero producido contra una familia determinada es bactericida dentro de la misma familia, pero no es activo contra cepas que expresan una de las otras dos familias, es decir, existe una protección cruzada dentro de la familiar pero no hay una protección cruzada entre familias.

Por tanto, para conseguir protección cruzada entre cepas usando NMB1870, se usa más de una familia. Para evitar la necesidad de expresar y purificar proteínas separadas, se ha propuesto expresar diferentes familias como proteínas híbridas [7], incluidas dos o tres de las tres familias en una sola cadena polipeptídica. Se han ensayado diversos híbridos y han proporcionado una alentadora eficacia anti-meningocócica.

Es un objeto de la invención proporcionar más y mejores estrategias para superar la especificidad de la familia de la protección proporcionada por NMB1870 y para usar estas estrategias para proporcionar inmunidad contra la enfermedad y/o infección menigocócicas, particularmente para el serogrupo B.

Descripción de la invención Los inventores han descubierto que NMB1870 expone algunos de sus epítopos en bucles de superficie situados entre hélices alfa. La sustitución de epítopes bucle de una familia en la posición bucle de otra familia permite que se produzcan NMB1870 quiméricas con antigenicidad multifamiliar.

Por tanto la invención proporciona proteínas NMB1870 quiméricas que comprenden partes de NMB1870 de diferentes familias como se define en las reivindicaciones. Mientras que cada familia de NMB1870 puede provocar anticuerpos (por ejemplo en ratones) que son eficaces solo contra cepas en la misma familia NMB1870, los polipéptidos quiméricos de la invención pueden provocar anticuerpos que reconozcan proteínas NMB1870 de más de una familia.

Las respuestas de anticuerpos bactericidas se miden convenientemente en ratones y son un indicador patrón de la eficacia de la vacuna [por ejemplo véase la nota final 14 de la referencia 4]. Las proteínas quiméricas pueden provocar preferentemente una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra al menos una cepa de N. meningitidis de cada uno de al menos dos de los siguientes tres grupos de cepas:

(I) MC58, gb185 (=M01-240185) , m4030, m2197, m2937, iss1001, NZ394/98, 67/00, 93/114, bz198, m1390, nge28, lnp17592, 00-241341, f6124, 205900, m198/172, bz133, gb149 (=M01-240149) , nm008, nm092, 30/00, 39/99, 72/00, 95330, bz169, bz83, cu385, h44/76, m1590, m2934, m2969, m3370, m4215, m4318, n44/89, 14847.

(II) 961-5945, 2996, 96217, 312294, 11327, a22, gb013 (=M01-240013) , e32, m1090, m4287, 860800, 599, 95N477, 90-18311, c11, m986, m2671, 1000, m1096, m3279, bz232, dk353, m3697, ngh38, L93/4286.

(III) M1239, 16889, gb355 (=M01-240355) , m3369, m3813, ngp165.

Por ejemplo, un polipéptido quimérico puede provocar una respuesta bactericida eficaz contra dos o más cepas de N. meningitidis del serogrupo B, MC58, 961-5945 y M1239.

Preferentemente, el polipéptido quimérico puede provocar una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra al menos el 50% de las cepas meningocócicas del serogrupo B clínicamente importantes (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más) . El polipéptido quimérico puede provocar una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra cepas de N. meningitidis del serogrupo B y cepas de al menos uno (por ejemplo 1, 2, 3, 4) de los serogrupos A, C,

W135 e Y. El polipéptido quimérico puede provocar una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra cepas de N. gonococcus y/o N. cinerea. El polipéptido quimérico puede provocar una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra cepas de al menos dos de las tres ramas principales del dendrograma mostrado en la Figura 5 de la referencia 3.

El polipéptido quimérico puede provocar una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra las cepas de N. meningitidis en al menos 2 (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7) de los linajes hipervirulentos ET-37, ET-5, grupo A4, linaje 3, subgrupo I, subgrupo III y subgrupo IV-1 [8, 9]. Adicionalmente las quimeras pueden provocar respuestas de anticuerpos bactericidas contra uno o más de linajes hiperinvasivos.

Las quimeras pueden provocar una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra las cepas de N. meningitidis al menos en 2 (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7) de los siguientes tipos de secuencia multilocus: ST1, ST4, ST5, ST8, ST11, ST32 y ST41 [10]. La quimera también puede provocar una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra cepas ST44.

La composición no tiene que inducir anticuerpos bactericidas contra todas y cada una de cepas de meningococo del serogrupo B, MenB, en los linajes especificados o MLST; sino que, para cualquier grupo determinado de cuatro o más cepas del meningococo del serogrupo B en un linaje hipervirulento particular o MLST, los anticuerpos inducidos por la composición son bactericidas contra el menos el 50% (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90% o más) del grupo. Los grupos de cepas preferidos incluirán cepas aisladas en al menos cuatro de los siguientes países: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, BR, y CU. Preferentemente, el suero tiene un título bactericida de al menos 1024 (por ejemplo 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 o mayor, preferentemente al menos 214) es decir, el suero puede destruir al menos el 50% de las bacterias de ensayo de una cepa particular cuando está diluida al 1:1024, como se describe, por ejemplo, en la nota final 14 de la referencia 4. Los polipéptidos quiméricos preferidos pueden provocar una respuesta de anticuerpos en ratones que permanezca bactericida incluso cuando el suero se ha diluido al 1:4096 o más.

La SEC ID Nº: 1 es la secuencia de longitud completa de NMB 1870 de la familia I de la cepa MC58 del serogrupo B:

Se destaca el extremo N de la lipoproteína madura procesada (Cys-20) .

Las secuencias de NMB1870 se incluyen dentro de tres familias [3, 7] que en el presente documento se denominan familias I, II y III. Las secuencias prototípicas para las familias I-III son, respectivamente, lasSEC ID Nos: 1-3. Los procedimientos filogenéticos y el dendrograma de la referencia 3 pueden seguirse para determinar fácilmente la familia para cualquier secuencia de NMB1870 determinada, y también puede usarse un alineamiento por pares con cada una de las tres secuencias de NMB1870 prototípicas para encontrar la coincidencia de familia más cercana. Las secuencias se incluyen claramente en las tres familias, siendo la identidad de secuencia del 74, 1% entre las familias I y II, del 62, 8% entre las familias I y III y del 84, 7% entre las familias II y III y siendo la variación de secuencia dentro de cada familia baja (por ejemplo un mínimo de identidad del 91, 6% en la familia I, del 93, 4% en la familia II y del 93, 2% en la familia III) . Como un modo rápido de determinar la secuencia de una familia sin necesitar un análisis filogenético, puede introducirse una secuencia en la familia I si esta tiene una identidad de secuencia de al menos 85% con la SEC ID Nº: 1, puede introducirse en la... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir una secuencia de aminoácidos NMB1870 quimérica, que comprende las etapas de: (a) alinear una primera secuencia de aminoácidos NMB1870 con una segunda secuencia de aminoácidos NMB1870, en la que la primera y segunda secuencias son diferentes y provienen de familias diferentes de 5 NMB1870, para proporcionar un par de secuencias alineadas; (b) seleccionar una parte de la primera secuencia de aminoácidos, comenzando en el aminoácido a1 de dicha primera secuencia de aminoácidos y acabando en el aminoácido b1 de dicha primera secuencia de aminoácidos, en la que la parte es una secuencia de superficie en bucle; (c) seleccionar una parte de la segunda secuencia de aminoácidos, comenzando en el aminoácido a2 de dicha segunda secuencia de aminoácidos y acabando en el aminoácido b2 de dicha segunda secuencia de aminoácidos,

en la que la parte es una secuencia de superficie en bucle y en la que los restos a1 y a2 así como b1 y b2 están alineados en el par de secuencias alineadas; y (d) reemplazar dicha parte de la primera secuencia de aminoácidos por dicha parte de la segunda secuencia de aminoácidos, proporcionando así la secuencia de aminoácidos NMB1870 quimérica, en la que la secuencias de aminoácidos comprenden una secuencia estructural, en ocho partes y siete bucles de superficie, uno entre cada parte de la secuencia estructural.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la primera secuencia es una secuencia NMB1870 de la familia 1.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la primera secuencia es la SEC ID Nº: 1.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que los bucles de superficie en la SEC ID Nº: 1 son: (1) los aminoácidos 134 a 141; (2) los aminoácidos 162 a 168; (3) los aminoácidos 181 a 182; (4) el aminoácido 197; (5) los aminoácidos 219 a 223; (6) los aminoácidos 234 a 236; (7) los aminoácidos 261 a 267.

5. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que la segunda secuencia es la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 3.

6. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que las partes seleccionadas tienen una longitud de al menos 3 aminoácidos.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la parte comprende el bucle de superficie (1) .

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la parte comprende el bucle de superficie (2) .

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la parte comprende el bucle de superficie (3) .

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la parte comprende el bucle de superficie (4) .

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la parte comprende el bucle de superficie 30 (5) .

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la parte comprende el bucle de superficie (6) .

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la parte comprende el bucle de superficie (7) .

14. Un polipéptido quimérico que comprende una secuencia de aminoácidos NMB1870 quimérica, que puede obtenerse por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

15. Un polipéptido que comprende secuencia de aminoácidos:

-B1-L1-B2-L2-B3-L3-B4-L4-B5-L5-B6-L6-B7-L7-B8

en la que:

(a) cada uno de dichos B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 y B8 es: (i) un fragmento de la SEC ID Nº: 1; y/o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con dicho fragmento de

(i) y/o que comprende un fragmento de al menos 6 aminoácidos contiguos de dicho fragmento de (i) ;

(b) cada uno de dichos L1, L2, L3, L4, L5, L6 y L7 es: (iii) un fragmento de la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2 y/o

SEC ID Nº: 3, a condición de que al menos uno de dichos L1, L2, L3, L4, L5, L6 y L7 no sea un fragmento de 45 la SEC ID Nº: 1,

y en la que de B1 a B8 se definen de la siguiente manera:

Coordenadas de aminoácidos dentro de la SEC ID Nº: 1

B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8

1-133 142-161 169-180 183-196 198-218 224-233 237-260 268-274

y en la que de L1 a L7 se definen de la siguiente manera:

Coordenadas de aminoácidos dentro de la SEC ID Nº: 1, 2 o 3

SEC L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7

1 134-141 162-168 181-182 197 219-223 234-236 261-267

2 134-141 162-167 180-181 196 218-222 233-235 260-266

3 142-149 170-175 188-189 204 226-230 241-243 268-274

16. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia global con la SEC ID Nº: 1 de al menos 80%, en la que: la identidad de dicha secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº: 1 es superior al 80% en las regiones estructurales de la SEC ID Nº: 1; y la identidad de secuencia de dicha secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº: 1 es inferior al 80% en las regiones en bucle de la SEC ID Nº: 1, en la que la secuencia de aminoácidos comprende una estructura, en ocho regiones estructurales, y siete regiones en bucle, una entre cada parte de la secuencia estructural.

17. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia global con la SEC ID Nº: 2 de al menos 80%, en la que: la identidad de secuencia de dicha secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2 es superior al 80% en las regiones estructurales de la SEC ID Nº: 2; y la identidad de secuencia de dicha secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2 es inferior al 80% en las regiones en bucle de la SEC ID Nº: 2, en la que la secuencia de aminoácidos comprende una estructura, en ocho regiones estructurales, y siete regiones en bucle, una entre cada parte de la secuencia estructural.

18. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia global con la SEC ID Nº: 3 de al menos 80%, en la que: la identidad de secuencia de dicha secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº: 3 es superior al 80% en las regiones estructurales de la SEC ID Nº: 3; y la identidad de secuencia de dicha secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº: 3 es inferior al 80% en las regiones en bucle de la SEC ID Nº: 3, en la que la secuencia de aminoácidos comprende una estructura, en ocho regiones estructurales, y siete regiones en bucle, una entre cada parte de la secuencia estructural.

19. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18.

20. Una composición inmunogénica que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18.

21. La composición de la reivindicación 20, que comprende adicionalmente un adyuvante de sal de aluminio.

22. La composición de la reivindicación 20 o reivindicación 21, que adicionalmente comprende una proteína PorA 25 meningocócica.

23. La composición de la reivindicación 20 o la reivindicación 21, que adicionalmente comprende una preparación de vesícula de la membrana externa de N. meningitidis.

24. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, para su uso como medicamento.