Antígenos de Neisseria meningitidis.

Una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos antigénica con homología de secuencia del 80% o superior con SEC ID Nº 2 ó SEC ID Nº 4,

con la condición de que dicha proteína no sea (i) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 7, ó (ii) un fragmento de SEC ID Nº 7.

Antígenos de Neisseria meningitidis.

La presente invención se refiere a antígenos de Neisseria meningitidis.

Antecedentes Neisseria meningitidis es un diplococo inmóvil, gram negativo patógeno del ser humano. Coloniza la faringe, causando meningitis y ocasionalmente septicemia en ausencia de meningitis. Está estrechamente relacionado con N. gonorrhoeae, aunque una característica que diferencia claramente a los meningococos de los gonococos es la presencia de una cápsula de polisacáridos que está presente en todos los meningococos patógenos.

N. meningitidis causa enfermedad endémica y epidémica. En los Estados Unidos el índice de infección es de 0, 6-1 por cada 100.000 personas al año, y puede ser mucho mayor durante los brotes (véase Lieberman y col., (1996) Safety and Immunogenicity of a Serogroups A/C Neisseria meningitidis Oligosaccharide-Protein Conjugate Vaccine in Young Children. JAMA 275 (19) : 1499-1503; Schuchat y col., (1997) Bacterial Meningitis in the United States in 1995. N Engl J Med 337 (14) : 970-976) . En los países en desarrollo, los índices de enfermedad endémica son mucho mayores y durante los casos de epidemia los índices pueden alcanzar hasta 500 casos por cada 100.000 personas al año. La mortalidad es extremadamente alta, del 10-20% en los Estados Unidos y mucho mayor en los países en desarrollo. Tras la introducción de la vacuna conjugada contra Haemophilus influenzae, N. meningitidis es la causa principal de meningitis bacteriana en todas las edades en los Estados Unidos (Schuchat y col. (1997) supra) .

Basándose en el polisacárido capsular del organismo se han identificado 12 serogrupos de N. meningitidis. El grupo A es el patógeno implicado más a menudo en la enfermedad epidémica en el África Subsahariana. Los serogrupos B y C son responsables de la amplia mayoría de casos en los Estados Unidos y en la mayoría de los países desarrollados. Los serogrupos W135 e Y son responsables del resto de casos de los Estados Unidos y de los países desarrollados. La vacuna contra meningococos usada actualmente es una vacuna de polisacárido tetravalente constituida por serogrupos A, C, Y y W135. Aunque es eficaz en adolescentes y en adultos, induce una respuesta inmune pobre y una corta duración de la protección, y no puede usarse en niños [por ejemplo, Morbidity and Mortality weekly report, Vol. 46, Nº RR-5 (1997) ]. Esto se debe a que los polisacáridos son antígenos independientes de las células T que inducen una respuesta inmune débil que no puede reforzarse mediante la inmunización repetida. Después del éxito de la vacunación contra H. influenzae, se han desarrollado vacunas conjugadas contra serogrupos A y C y están en la etapa final del ensayo clínico (Zollinger WD "New and Improved Vaccines Against Meningococcal Disease" en: New Generation Vaccines, supra, págs. 469-488; Lieberman y col. (1996) supra; Costantino y col. (1992) Development and phase I clinical testing of a conjugate vaccine against meningococcus A and C. Vaccine 10: 691-698) .

Sin embargo, el meningococo B sigue siendo un problema. Este serotipo es responsable actualmente de aproximadamente el 50% de todas las meningitis en los Estados Unidos, Europa, y Sudamérica. El enfoque de polisacáridos no puede usarse debido a que el polisacárido capsular de menB es un polímero de ácido N-acetil neuramínico con enlace α (2-8) que también está presente en el tejido de los mamíferos. Esto da por resultado en la tolerancia al antígeno; de hecho, si se provocara una respuesta inmune, sería autoinmune, y por consiguiente no deseable. Para evitar la inducción de autoinmunidad e inducir una respuesta inmune protectora, por ejemplo, se ha modificado químicamente el polisacárido capsular sustituyendo los grupos N-acetilo con grupos N-propionilo, dejando inalterada la antigenicidad específica (Romero & Outschoorn (1994) Current status of Meningococcal group B vaccine candidates: capsular or non-capsular? Clin Microbiol Rev 7 (4) : 559-575) .

Los enfoques alternativos para vacunas contra menB han usado mezclas complejas de proteínas de la membrana externa (OMP) , que contenían o las OMP en solitario u OMP enriquecidas con porinas o con una deleción en las OMP de clase 4 que se cree inducen anticuerpos que bloquean la actividad bactericida. Este enfoque produce vacunas que no están bien caracterizadas. Éstas son capaces de proteger contra la cepa homóloga, pero no son eficaces en general, ya que existen muchas variantes antigénicas de las proteínas de la membrana externa. Para superar la variabilidad antigénica, se han construido vacunas multivalentes que contienen hasta nueve porinas diferentes (por ejemplo, Poolman JT (1992) Development of a meningococcal vaccine. Infect. Agents Dis, 4: 13-28) . Las proteínas adicionales a usarse en vacunas de la membrana externa han sido las proteínas opa y opc, pero ninguno de estos enfoques ha sido capaz de superar la variabilidad antigénica (por ejemplo, Ala'Aldeen & Borriello (1996) The meningococcal transferrin-binding proteins 1 and 2 are both surface exponed and generate bactericidal antibodies capable of killing nomologous and heterologous strains. Vaccine 14 (1) : 49-53) .

Para los genes y proteínas de los gonococos y meningococos está disponible una cierta cantidad de datos de secuencias (por ejemplo documentos EP-A-0467714, WO 96/29412) , pero no están de ninguna manera completos. El suministro de secuencias adicionales podría proporcionar una oportunidad para identificar proteínas secretadas o expuestas en la superficie que sean presuntas dianas para el sistema inmune y que no sean antigénicamente variables. Por ejemplo, algunas de las proteínas identificadas podrían ser componentes de vacunas eficaces contra meningococos B, algunas podrían ser componentes de vacunas contra todos los serotipos de meningococos y otras podrían ser componentes de vacunas contra todos los serotipos de meningococos, y otros podrían ser componentes de vacunas contra todas las Neisseriae patogénicas.

El documento WO 99/3113 desvela un polipéptido de superficie de Neisseria meningitidis llamado "HiaNm". El polipéptido tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (SEC. ID Nº: 7 en el presente documento) :

Cierto contenido relacionado con HiaNm se da a conocer en el presente documento.

El Ejemplo 2 del documento WO 99/31132 informa que HiaNm es homólogo a hia y hsf d Haemophilus influenzae, como se dio a conocer en el documento WO 96/30519.

La invención

La invención proporciona proteínas que comprenden las secuencias de aminoácidos de N. meningitidis descritas en el ejemplo.

También proporciona proteínas que comprenden secuencias homólogas (es decir que tienen identidad de secuencias) a las secuencias de aminoácidos de N. meningitidis dadas a conocer en los ejemplos. El grado de identidad de secuencia es del 80% o más. Estas proteínas homólogas incluyen mutantes y variantes alélicas de las secuencias descritas en el ejemplo. Típicamente, se considera que 50% de identidad o más entre dos proteínas es una indicación de equivalencia funcional. La identidad entre proteínas se determina de preferencia mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman como está implementado en el programa MPSRCH (Oxford Molecular) , usando una búsqueda de huecos afines con parámetros de penalización de hueco abierto = 12 y penalización de extensión de hueco = 1.

La invención proporciona adicionalmente proteínas que comprenden fragmentos de secuencias de aminoácidos de N. meningitidis descritos en el ejemplo. Los fragmentos deben comprender al menos 20 aminoácidos consecutivos de las secuencias y comprender un epítopo de la secuencia.

Las proteínas de la invención pueden, por supuesto, prepararse mediante diversos medios (por ejemplo expresión recombinante, purificación a partir de cultivo celular, síntesis química, etc.) y en diversas formas (por ejemplo nativa, condensaciones, etc.) . Se preparan de preferencia en forma sustancialmente pura o aislada (es decir sustancialmente libre de otras N. meningitidis o proteínas celulares del huésped) .

Según otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos que se unen a estas proteínas. Éstos pueden ser policlonales o monoclonales y pueden producirse mediante cualquier medio adecuado.

Según otro aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican las proteínas y fragmentos de proteína de la invención. Según otro aspecto, la invención proporciona ácidos... [Seguir leyendo]

1. Una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos antigénica con homología de secuencia del 80% o superior con SEC ID Nº 2 ó SEC ID Nº 4, con la condición de que dicha proteína no sea (i) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 7, ó (ii) un fragmento de SEC ID Nº 7.

2. La proteína de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos con homología de secuencia del 80% o superior con SEC ID Nº 2.

3. La proteína de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos con homología de secuencia del 80% o superior con SEC ID Nº 4.

4. La proteína de la reivindicación 2, que comprende una secuencia de aminoácidos con homología de secuencia del 90% o superior con SEC ID Nº 2.

5. La proteína de la reivindicación 3, que comprende una secuencia de aminoácidos con homología de secuencia del 90% o superior con SEC ID Nº 4.

6. La proteína de la reivindicación 4, que comprende una secuencia de aminoácidos con homología de secuencia del 95% o superior con SEC ID Nº 2.

7. La proteína de la reivindicación 5, que comprende una secuencia de aminoácidos con homología de secuencia del 95% o superior con SEC ID Nº 4.

8. La proteína de la reivindicación 6, que comprende una secuencia de aminoácidos con homología de secuencia del 99% o superior con SEC ID Nº 2.

9. La proteína de la reivindicación 7, que comprende una secuencia de aminoácidos con homología de secuencia del 99% o superior con SEC ID Nº 4.

10. La proteína de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2.

11. La proteína de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 4.

12. La proteína de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 6.

13. Una proteína que comprende un fragmento de al menos 20 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2 ó SEC ID Nº 4, en la que dicho fragmento comprende un epítopo de SEC ID Nº 2 ó SEC ID Nº 4, con la condición de que dicha proteína no sea (i) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 7, ó (ii) un fragmento de SEC ID Nº 7.

14. La proteína de la reivindicación 13, en la que dicho fragmento comprende un epítopo de SEC ID Nº 2.

15. La proteína de la reivindicación 13, que comprende un fragmento de al menos 20 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2.

16. La proteína de la reivindicación 13, en la que dicho fragmento comprende un epítopo de SEC ID Nº 4.

17. La proteína de la reivindicación 13, que comprende un fragmento de al menos 20 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 4.

18. La proteína de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proteína es una proteína de fusión.

19. La proteína de la reivindicación 18, que es una fusión con GST.

20. La proteína de la reivindicación 18, que es una fusión con seis residuos histidina.

21. Una proteína que comprende (i) una secuencia antigénica de aminoácidos con homología de secuencia del 80% o superior con SEC ID Nº 2 o (ii) un fragmento de al menos 20 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2 en la que dicho fragmento comprende un epítopo de SEC ID Nº 2, en la que la proteína es una proteína de fusión que incluye seis residuos histidina.

22. La proteína de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se prepara por medio de expresión recombinante.

23. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, que se prepara por purificación a partir del cultivo celular.

24. Un anticuerpo que se une a una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

25. El anticuerpo de la reivindicación 24, que es monoclonal.

26. El anticuerpo de la reivindicación 24, que es policlonal.

27. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

28. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 27, que comprende un fragmento de al menos 10 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID Nº: 1, 3 y 5.

29. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 28, que comprende un fragmento de al menos 12 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos en dicho grupo.

30. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 28, que comprende un fragmento de al menos 14 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos en dicho grupo.

31. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 28, que comprende un fragmento de al menos 15 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos en dicho grupo.

32. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 28, que comprende un fragmento de al menos 18 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos en dicho grupo.

33. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 28, que comprende un fragmento de al menos 20 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos en dicho grupo.

34. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 28, que comprende un fragmento de al menos 25 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos en dicho grupo.

35. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 28, que comprende un fragmento de al menos 30 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos en dicho grupo.

36. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 28, que comprende un fragmento de al menos 35 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos en dicho grupo.

37. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 28, que comprende un fragmento de al menos 40 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos en dicho grupo.

38. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 28, que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 1.

39. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 28, que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 3.

40. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 39, que es ADN.

41. Un vector que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 40.

42. El vector de la reivindicación 41, que es un vector de expresión.

43. Un vector de expresión bacteriano que codifica (i) una proteína que comprende una secuencia antigénica de aminoácidos con homología de secuencia del 80% o superior con SEC ID Nº 2 ó (ii) una proteína que comprende un fragmento de al menos 20 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2 en la que dicho fragmento comprende un epítopo de SEC ID Nº 2; en el que el vector incluye una secuencia Shine-Dalgarno.

44. El vector de la reivindicación 42 ó reivindicación 43, en el que el vector puede estar integrado en un genoma bacteriano.

45. Un vector de expresión bacteriano que codifica (i) una proteína que comprende una secuencia antigénica de aminoácidos con homología de secuencia del 80% o superior con SEC ID Nº 2 ó (ii) una proteína que comprende un fragmento de al menos 20 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2 en la que dicho fragmento comprende un epítopo de SEC ID Nº 2; en el que el vector es un vector de integración que puede estar integrado en un genoma bacteriano.

46. El vector de la reivindicación 44 ó reivindicación 45, en el que el vector incluye un marcador seleccionable para permitir la selección de una cepa bacteriana que se ha transformado.

47. El vector de la reivindicación 46, en el que el marcador seleccionable es un gen que hace a la bacteria resistente a un fármaco seleccionado del grupo constituido por: ampicilina; cloramfenicol; eritromicina; kanamicina; neomicina; y tetraciclina.

48. Una célula huésped transformada con un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 47.

49. La célula huésped de la reivindicación 48, que es una bacteria, una levadura o una célula de mamífero.

50. La célula huésped de la reivindicación 49, que es una bacteria.

51. La célula huésped de la reivindicación 50, en la que la bacteria es una E. coli.

52. Una célula huésped bacteriana transformada con un vector que codifica (i) una proteína que comprende una secuencia antigénica de aminoácidos con homología de secuencia del 80% o superior con SEC ID Nº 2 ó (ii) una proteína que comprende un fragmento de al menos 20 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2 en la que dicho fragmento comprende un epítopo de SEC ID Nº 2; con la condición de que la célula huésped no sea una Salmonella o una E. coli.

53. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 50 a 52, en la que el vector incluye un promotor bacteriano.

54. La célula huésped de la reivindicación 53, en la que el promotor bacteriano es de una enzima de ruta metabólica.

55. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 50 a 54, en la que el vector es un vector de integración que puede estar integrado en el genoma bacteriano.

56. Una composición que comprende una proteína, una molécula de ácido nucleico, o un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40.

57. Una composición según la reivindicación 56 que es una composición de vacuna o una composición de diagnóstico.

58. La composición de la reivindicación 57, que es una composición de vacuna.

59. Una composición según la reivindicación 57, para uso como un medicamento.

60. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 56 a 59, que incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable.

61. La composición de la reivindicación 60, en la que el vehículo comprende un polisacárido.

62. La composición de la reivindicación 60, en la que el vehículo comprende disolución salina.

63. La composición de la reivindicación 60, en la que el vehículo comprende una sustancia tamponadora del pH.

64. Una composición que comprende: (i) una proteína que comprende una secuencia antigénica de aminoácidos con homología de secuencia del 80% o superior con SEC ID Nº 2 ó una proteína que comprende un fragmento de al menos 20 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2 en la que dicho fragmento comprende un epítopo de SEC ID Nº 2; y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable que comprende disolución salina, un polisacárido, un ácido poliláctico, un ácido poliglicólico o una sustancia tamponadora del pH.

65. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 56 a 64, preparada como un inyectable.

66. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 56 a 64, preparada como una sólida adecuada para disolución en, o suspensión en, un vehículo líquido antes de la inyección.

67. Una composición que comprende: (i) una proteína que comprende una secuencia antigénica de aminoácidos con homología de secuencia del 80% o superior con SEC ID Nº 2 ó una proteína que comprende un fragmento de al menos 20 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2 en la que dicho fragmento comprende un epítopo de SEC ID Nº 2; y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que la composición es un inyectable.

68. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 56 a 67, que incluye un adyuvante.

69. La composición de la reivindicación 68, en la que el adyuvante se selecciona de: una sal de aluminio; una emulsión de aceite en agua; una saponina; o una citocina.

70. La composición de la reivindicación 69, en la que el adyuvante es un hidróxido de aluminio o una sal de fosfato de aluminio.

71. Una composición que comprende: (i) una proteína que comprende una secuencia antigénica de aminoácidos con homología de secuencia del 80% o superior con SEC ID Nº 2 ó una proteína que comprende un fragmento de al menos 20 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2 en la que dicho fragmento comprende un epítopo de SEC ID Nº 2; y (ii) un adyuvante seleccionado de hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio o sulfato de aluminio.

72. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 56 a 59, que incluye quitosano.

73. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 56 a 59, que incluye poli (lactida-co-glicólido) .

74. El uso de la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la infección por bacterias Neisseria, en particular Neisseria meningitidis.

75. El uso de (i) una proteína que comprende una secuencia antigénica de aminoácidos con homología de secuencia del 80% o superior con SEC ID Nº 2, o (ii) una proteína que comprende un fragmento de al menos 20 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2 en la que dicho fragmento comprende un epítopo de SEC ID Nº 2, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la infección por Neisseria meningitidis serogrupo B.

76. Un procedimiento para producir la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, que comprende la etapa de cultivar una célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 48 a 55 bajo condiciones que inducen la expresión de proteínas.