Antígenos Neisseriales conservados.

Una proteína que comprende un fragmento de al menos n aminoácidos conservados consecutivos de las SEC IDNos:

1-21, en la que n es 7 y el fragmento comprende una región antigénica de la SEC ID Nº, a condición de que laproteína no comprenda ninguna de las SEC ID Nos: 254-267.

Antígenos Neisseriales conservados Campo de la invención La presente invención se refiere a antígenos de bacterias del género Neisseria conservados.

Antecedentes de la técnica Las bacterias Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae son diplococos gram negativos, inmóviles, que son patógenos en seres humanos.

Basándose en el polisacárido capsular del organismo, se han identificado 12 serogrupos de N. meningitidis. El grupoA es el patógeno más frecuentemente implicado en enfermedades epidémicas en el África subsahariano. Los serogrupos B y C son los responsables de la inmensa mayoría de los casos en los Estados Unidos y en países más desarrollados. Los serogrupos W135 e Y son responsables del resto de los casos en los Estados Unidos y en países desarrollados.

La vacuna meningocócica actualmente en uso es una vacuna polisacárida tetravalente compuesta por los serogrupos A, C, Y y W135. Sin embargo, esta estrategia no puede usarse para el Meningoco B, porque el polisacárido capsular del menB es un polímero de ácido N-acetil neuramínico unido a a (2-8) que está también presente en el tejido de mamíferos. Una estrategia de una vacuna para el menB utiliza mezclas de proteínas de membrana externa (PME) . Para superar la variabilidad antigénica, se han construido vacunas multivalentes que contienen hasta nueve porinas diferentes [por ejemplo, Poolman (1992) Development of a meningococcal vaccine. Infect. Agents Dis. 4: 13-28]. Otras proteínas utilizadas en vacunas de membrana externa han sido las proteínas opa y opc, pero ninguna de estas estrategias han podido superar la variabilidad antigénica [por ejemplo, Ala’Aldeen y Borriello (1996) The meningococcal transferrin-binding proteins 1 and 2 are both surface exposed and generate bactericidal antibodies capable of killing homologous and heterologous strains. Vaccine 14 (1) : 49-53].

En los documentos WO99/24578, WO99/36544, WO99/57280 y WO00/22430 se desvela una gran cantidad de proteínas y secuencias de nucleótidos de Neisseria. Tettelin y col. en [Science (2000) 287: 1809-1815] desvelan datos exhaustivos de secuencias de la cepa MC58.

Descripción de la invención Para garantizar un reconocimiento y una reactividad máximos de cepas cruzadas, pueden usarse regiones de proteínas que están conservadas entre diferentes especies, serogrupos y cepas de Neisseria. Por lo tanto, la invención proporciona proteínas que comprenden tramos de secuencias de aminoácidos compartidos en la mayor parte del género Neisseria, particularmente en N. meningitidis y N. gonorrhoeae.

La invención proporciona una proteína que comprende un fragmento de una proteína Neisserial, en el que dicho fragmento consta de n aminoácidos consecutivos conservados, siempre que la invención no incluya en su ámbito proteínas Neisseriales de longitud completa. Dependiendo de la proteína concreta, n tiene un valor de 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 o más) . El fragmento comprende una región antigénica de la proteína Neisserial.

Un aminoácido “conservado” es un aminoácido que, en una proteína de Neisseria concreta, está presente al menos en un x % de Neisseria. El valor de x puede ser de 50% o mayor, por ejemplo de 66%, 75%, 80%, 90%, 95% o incluso de 100% (es decir, el aminoácido se encuentra en la proteína en cuestión en todo el género Neisseria) .

Para determinar si un aminoácido está “conservado” en una proteína Neisserial concreta, es necesario comparar este resto de aminoácido en las secuencias de la proteína en cuestión a partir de una pluralidad de diferentes especies de Neisseria (una “población de referencia”) . La población de referencia puede incluir diversas especies de Neisseria diferentes (preferentemente N. meningitidis y N.gonorrhoeae) o puede incluir una sola especie. La población de referencia puede incluir diversos serogrupos diferentes de una especie concreta (tales como los serogrupos A, B, C, W135, X, Y, Z y 29E de N. meningitidis) o un solo serogrupo. La población de referencia también puede incluir diversas cepas diferentes de un serogrupo concreto (tales como las cepas NG6/88, BZ198, NG3/88, 297-0, BZ147, BZ169, 528, BZ133, NGE31, NGH38, NGH15, BZ232, BZ83 y 44/76 de N. meningitidis B) . Una población de referencia preferida consta de las 5 cepas más comunes de N. meningitidis y/o de las 5 cepas más comunes de N. gonorrhoeae.

La población de referencia comprende preferentemente cepas k extraídas de diferentes ramas k de un árbol filogenético adecuado, tales como los descritos en (a) Ni y col. (1992) Epidemiol Infect 109: 227-239 (b) Wolff y col. (1992) Nucleic Acids Res 20: 4657 (c) Bygraves y Maiden (1992) J. Gen. Microbiol. 138: 523-531 (d) Caugant y col. (1987) J. Bacteriol. 69: 2781-2792. Otro árbol filogenético que puede usarse se muestra en la Figuras 8 y 9b del presente documento.

Se apreciará que, en la población de referencia, sólo se incluirá una especie, serogrupo o cepa concretos, si ésta codifica la proteína en la cual se localiza el aminoácido en cuestión. En el caso de aminoácidos incluidos en la ORF40, descrita más adelante, la población de referencia no debe incluir N. gonorrhoeae porque esta especie no contiene la ORF40.

Para proteínas solo encontradas en N. meningitidis, una población de referencia preferida comprende:

• N. meningitidis A, cepa Z2491 5 • N. meningitidis B, cepa NG6/88

• N. meningitidis W, cepa A22

Las secuencias de aminoácidos de diferentes Neissierias pueden compararse fácilmente usando ordenadores. Típicamente esto implicará el alineamiento de diversas secuencias usando un algoritmo tal como CLUSTAL [Thompson y col. (1994) Nucleic “Acids Res 22: 4673=4680; Trends Biochem Sci (1998) 23: 403-405] o,

preferentemente, PILEUP [parte del paquete informático GCG de Wisconsin, preferentemente la versión 9.0].

Los aminoácidos conservados se aprecian fácilmente en un alineamiento de secuencias múltiple - en la posición del aminoácido en cuestión un gran parte de las secuencias alineadas contendrán el aminoácido en particular. Los aminoácidos conservados pueden apreciarse más visualmente usando un programa tal como BOXSHADE [disponible, por ejemplo, on-line en el NIH], PRETYBOX [GCG] Wisconsin, versión 10] o JALVIEW [disponible on

line en el EBI].

Preferentemente, la proteína comprende un fragmento de una de las proteínas desveladas en los documentos WO99/24578, WO99/36544, WO99/57280 o WO00/22430, o un fragmento de una de las 2158 ORF desveladas por Tettelin y col. en [Science (2000) 287:1809-1815]. Más particularmente, la proteína comprende preferentemente un fragmento de la ORF40. La proteína de la invención no comprenderá ninguna secuencia de las proteínas explícitamente desveladas en los documentos WO99/24578, WO99/36544, WO99/57280, WO00/22430 o por Tettelin y col.

El documento WO99/36544 desvela proteínas neisseriales con las siguientes secuencias de aminoácidos:

<SEC ID Nº 254>

<SEC ID Nº 255>

<SEC ID Nº 256>

El documento WO99/31132 desvela proteínas neisseriales con las siguientes secuencias de aminoácidos: <SEC ID Nº 257>

<SEC ID Nº 258> <SEC ID Nº 259>

<SEC ID Nº 260>

<SEC ID Nº 261>

<SEC ID Nº 262>

<SEC ID Nº 263>

<SEC ID Nº 264>

<SEC ID Nº 265>

<SEC ID Nº 266>

La invención también proporciona una proteína que comprende una de las secuencias mostradas en las Figuras.

Las proteínas de la invención pueden prepararse, por supuesto, mediante diversos medios (por ejemplo, por

expresión recombinante, expresión natural, purificación a partir de cultivo celular, síntesis química, etc.) y en diversas formas (por ejemplo, natural, fusiones, etc.) . Preferentemente, se preparan de una forma sustancialmente pura (es decir, sustancialmente libre de otras proteínas Neisseriales o células huésped) .

También se desvelan anticuerpos que se unen a estas proteínas. Éstos pueden ser policlonales o monoclonales y pueden producirse mediante cualquier medio adecuado.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención proporciona ácido nucleico que codifica las proteínas de la invención. También debe apreciarse que la invención proporciona ácidos nucleicos que comprenden secuencias complementarias a éstos (por ejemplo para fines antisentido o exploración) .

Adicionalmente, la invención proporciona ácido nucleico que puede hibridarse con el ácido nucleico de N. meningitidis desvelado en los ejemplos, preferentemente en condiciones de “alta... [Seguir leyendo]

1. Una proteína que comprende un fragmento de al menos n aminoácidos conservados consecutivos de las SEC ID Nos: 1-21, en la que n es 7 y el fragmento comprende una región antigénica de la SEC ID Nº, a condición de que la proteína no comprenda ninguna de las SEC ID Nos.

25. 267.

2. La proteína de la reivindicación 1, en la que n es 8.

3. La proteína de la reivindicación 1, en la que n es 10.

4. La proteína de la reivindicación 1, en la que n es 12.

5. La proteína de la reivindicación 1, en la que n es 14.

6. La proteína de la reivindicación 1, en la que n es 16.

7. La proteína de la reivindicación 1, en la que n es 18.

8. La proteína de la reivindicación 1, en la que n es 20.

9. La proteína de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEC ID Nos: 1-4, 6-8, 10 o 13-21.

10. La proteína de cualquier reivindicación anterior, en la que la proteína es una proteína de fusión.

11. La proteína de cualquier reivindicación anterior, que está preparada por expresión recombinante.

12. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que está preparada por purificación a partir de un cultivo celular.

13. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13, que es ADN.

15. Un vector que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14.

16. El vector de la reivindicación 15, que es un vector de expresión.

17. Un vector de expresión que codifica una proteína que comprende un fragmento de al menos 7 aminoácidos conservados consecutivos de las SEC ID Nos: 1 a 21, y el fragmento comprende una región antigénica de la SEC ID Nº, en el que el vector incluye una secuencia de Shine-Dalgarno, a condición de que la proteína no comprenda ninguna de las SEC ID Nos.

25. 256.

18. Un vector de expresión que codifica una proteína que comprende un fragmento de al menos 7 aminoácidos conservados consecutivos de las SEC ID Nos: 1-21, y el fragmento comprende una región antigénica de la SEC ID Nº, en el que el vector es un vector de integración que puede integrarse en un genoma bacteriano, a condición de que la proteína no comprenda ninguna de las SEC ID Nos.

25. 256.

19. El vector de la reivindicación 17 o 18, en el que el vector incluye un marcador de selección que permite la selección de una cepa bacteriana que ha sido transformada.

20. El vector de la reivindicación 19, en el que el marcador de selección es un gen que confiere a las bacterias resistencia a un fármaco seleccionado del grupo que consiste en: ampicilina; cloranfenicol; eritromicina; kanamicina; neomicina y tetraciclina.

21. Una célula huésped transformada con el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20.

22. La célula huésped de la reivindicación 21, que es una bacteria, una levadura o una célula de mamífero.

23. La célula huésped de la reivindicación 22, que es una bacteria.

24. La célula huésped de la reivindicación 23 en la que la bacteria es una E.coli.

25. Una composición que comprende una proteína, o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

26. Una composición de acuerdo con la reivindicación 25, para su uso como un medicamento.

27. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 26, que incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable.

28. La composición de la reivindicación 27, en la que el vehículo comprende solución salina.

29. La composición de la reivindicación 27, en la que el vehículo comprende una sustancia tampón de pH.

30. Un procedimiento para producir la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende la etapa de cultivar una célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 en condiciones que induzcan la expresión de la proteína.

31. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos:

MNKIYRIIWNSALNAWV; VSELTRNHTKRASATV.