ENSAYO DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE PROXIMIDAD DE QUIMIOLUMINISCENCIA.

Ensayo de ácidos nucleicos de proximidad de quimioluminiscencia. Campo de la invención La presente invención se refiere a la detección y la cuantificación de ácidos nucleicos diana en una mezcla heterogénea presente en una muestra y a los procedimientos de aplicación de las mismas. El sistema de detección comprende una molécula quimioluminiscente, un sustrato quimioluminiscente, un colorante que responde a la luz cuando se intercala en un ácido nucleico y una diana de ácido nucleico. El procedimiento requiere la creación de una determinada estructura tridimensional (esto es, un colorante intercalado en el ácido nucleico) a fin de que el colorante acepte energía y requiere que el donante de energía (una molécula quimioluminiscente) está dispuesto próximo a dicha estructura. La presente invención resulta útil en cualquier aplicación en la que sea deseable la detección de una secuencia específica de ácido nucleico o la detección de enzimas que modifican ácidos nucleicos, tal como en la realización de diagnósticos, proyectos de investigación y aplicaciones industriales. Antecedentes de la invención Los ácidos nucleicos se miden a fin de identificar moléculas de una secuencia de ácidos nucleicos diana específica en una población de ácidos nucleicos, ADN o ARN heterogéneos, o para medir los productos de las reacciones en las que se modifican ácidos nucleicos, ADN o ARN. Normalmente, dichas mediciones son combinaciones de los procedimientos siguientes: a. cuando el ácido nucleico de partida es ARN, la conversión a ADN se lleva a cabo mediante una reacción de transcripción inversa. Los cebadores oligonucleótidos para dicha reacción de transcripción inversa pueden ser específicos para la secuencia diana o pueden ser generales para la conversión de todas las secuencias de ARN en ADN; b. amplificación del ácido nucleico diana mediante reacciones específicas de la secuencia diana. Dichas reacciones incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores específicos de secuencia y reacciones de extensión del cebador, de nuevo con un cebador oligonucleótido específico de la secuencia diana. También se ha utilizado la amplificación por círculo rodante de ADN para amplificar las secuencias específicas de ADN; c. separación física de los ácidos nucleicos heterogéneos. Dichas separaciones físicas comprenden de manera no limitativa, fraccionamiento por tamaño y separación por afinidad cuando los ácidos nucleicos amplificados se producen con sustratos derivados, incluidos, aunque sin limitarse a los mismos, trifosfatos desoxirribonucleótidos biotinilados; d. marcaje del ácido nucleico. Tal como se ha mencionado en el punto c. anterior, los ácidos nucleicos amplificados se pueden marcar utilizando trifosfatos desoxirribonucleótidos derivados o cebadores oligonucleótidos derivados (ARN o ADN); y e. detección de los ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos se pueden detectar a través del resto de marcaje o mediante separación física seguida de detección con colorantes específicos de los ácidos nucleicos. Uno de los procedimientos más comunes para la detección cuantitativa de secuencias diana es la amplificación específica de secuencia de la secuencia o secuencias diana por PCR, ya sea a partir de ADN o ADNc tras una transcripción inversa, separación física mediante electroforesis en gel o capilar y detección por marcaje fluorescente (por ejemplo, de ADN bicatenario mediante bromuro de etidio o mediante la utilización de cebadores marcados con fluorescencia en la amplificación). Otra técnica habitual para la detección cuantitativa de la secuencia o secuencias diana comprende PCR "en tiempo real". La tecnología PCR es ampliamente utilizada para ayudar en la cuantificación del ADN, dado que la amplificación de la secuencia diana permite una sensibilidad de detección mayor de la que se podría alcanzar de otro modo. El punto en el que se mide la señal fluorescente con el fin de calcular la cantidad inicial de plantilla puede ser al final de la reacción (PCR cuantitativa o QPCR de punto final) o mientras tiene lugar la amplificación (QPCR en tiempo real). El procedimiento más sensible y reproducible de QPCR en tiempo real mide la fluorescencia en cada ciclo a medida que progresa la ampliación. La molécula indicadora utilizada en las reacciones de QPCR en tiempo real puede ser (1) una sonda específica de secuencia compuesta por un oligonucleótido marcado con un colorante fluorescente más un silenciador o (2) un ADN no específico enlazado a un colorante que emite fluorescencia cuando se une a ADN bicatenario. Estas dos técnicas, así como otras que no se describen en detalle, requieren instrumentación para la separación física o la detección. Esta necesidad de instrumentación y/o tecnologías de separación con su correspondiente manejo de la muestra limita la utilización de la detección cuantitativa y cualitativa de secuencias diana. En 2 E06784583 14-11-2011   consecuencia, existe la necesidad de disponer de procedimientos para la detección y medición de ácidos nucleicos que no requieran una instrumentación costosa y delicada para la separación de la muestra o para la detección. Dichas mediciones incluyen, aunque sin limitarse a las mismas, la identificación de moléculas de una secuencia específica de ácido nucleico, así como la detección de ácidos nucleicos que son el producto de reacciones de modificación de los ácidos nucleicos. Las reacciones de modificación de los ácidos nucleicos comprenden de manera no limitativa, reacciones de polimerización, reacciones de ligadura, reacciones de nucleasa y reacciones de recombinación. Colorantes fluorescentes de intercalación de ácidos nucleicos Un procedimiento habitual para la detección de ácidos nucleicos consiste en el marcaje de los mismos con colorantes fluorescentes de intercalación. Dichos colorantes tienen diversas características únicas que los hacen especialmente útiles: 1) Elevada absortividad molar; 2) Fluorescencia intrínseca muy baja: 3) Elevada potenciación de la fluorescencia al unirse a ácidos nucleicos; y 4) Afinidad de moderada a alta por los ácidos nucleicos, con poca o nula tinción de otros biopolímeros. Los colorantes de intercalación de ácidos nucleicos presentan excitaciones y emisiones de fluorescencia que comprenden el espectro de luz visible desde el azul al infrarrojo próximo, con picos de absorción adicionales en el UV, lo que los hace compatibles con muchos tipos diferentes de instrumentación. Estos colorantes se excitan con una fuente de luz extrínseca que presenta un espectro que se superpone con la longitud de onda de excitación máxima del colorante de intercalación. Se pueden utilizar para visualizar ARN y ADN. A continuación se indican algunos colorantes habituales. Nombre del colorante Ex/Em * Aplicación Bromuro de etidio 300/600 Cuantificación y detección de ADN bicatenario Bromuro de etidio homodímero-1 510/620 Cuantificación y detección de ADN bicatenario Reactivo de cuantificación PicoGreen ® 502/523 ADN bicatenario Reactivo de cuantificación OliGreen ® 498/518 Cuantificación y detección de ADN monocatenario y oligonucleótidos Reactivo de cuantificación RiboGreen ® 500/520 Cuantificación y detección de ARN Colorante SYBR Gold ® 495/537 Cuantificación y detección de ADN o ARN monocatenario o bicatenario tras electroforesis Colorante SYBR Green I ® 494/521 Cuantificación y detección de ADN bicatenario y oligonucleótidos tras electroforesis. También es útil en ensayos de PCR en tiempo real Colorante SYBR Green ® 492/513 Colorante sensible para ARN y ADN monocatenario tras electroforesis Colorante SYBR Safe ® 502/530 Colorante en gel sensible a ADN con mutagenicidad significativamente reducida Colorante SYBR DX DNA Blot ® 475/499 Colorante sensible para ADN * Los máximos de excitación (Ex) y emisión (Em) son respectivamente la longitud de onda en nanómetros (nm) de luz que produce la máxima excitación del colorante intercalado y la longitud de onda de luz a la que se produce la máxima emisión cuando el colorante emite fluorescencia. Transferencia de energía por resonancia La energía se puede transmitir al colorante intercalado en el ácido nucleico mediante fotones o mediante transferencia de energía por resonancia. El principio de la transferencia de energía entre dos moléculas se puede aprovechar como medios para obtener información sobre los cambios experimentados en su proximidad y orientación relativas. La transferencia de energía por resonancia (RET por sus siglas en inglés) es la transferencia de energía del estado excitado de una molécula donante a una molécula receptora. La transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) es una interacción dependiente de la distancia entre los estados electrónicos excitados de dos moléculas de colorante... [Seguir leyendo]

a) proporcionar una muestra de la que se sospecha que contiene un ácido nucleico de interés; b) poner en contacto la muestra con una molécula de ácido nucleico complementaria del ácido nucleico de interés para formar una doble cadena de ácido nucleico; c) poner en contacto la muestra con un colorante de intercalación para generar una doble cadena de ácido nucleico unida a colorante, y con una molécula quimioluminiscente, en el que dicha molécula quimioluminiscente es seleccionada de entre el grupo constituido por la luciferasa, la luciferasa de luciérnaga, la fosfatasa alcalina y la peroxidasa de rábano picante; d) activar dicha molécula quimioluminiscente mediante la adición de un sustrato quimioluminiscente para producir luz, en el que la luz excita el colorante de intercalación en la doble cadena unida a colorante, y e) detectar la luz emitida por el colorante de intercalación, detectándose así un ácido nucleico de interés. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico de interés está asociado a dicha molécula quimioluminiscente. 3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico complementario del ácido nucleico de interés está asociado a dicha molécula quimioluminiscente. 4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico de interés se selecciona de entre el grupo constituido por ADN, ARN y sus derivados. 5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico complementario del ácido nucleico de interés se selecciona de entre el grupo constituido por ADN, ARN y sus derivados. 6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha molécula quimioluminiscente se activa mediante una luciferina. 7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicha luciferina se selecciona de entre el grupo constituido por luciferina de luciérnaga, coelenterazina, luciferina bacteriana, luciferina de dinoflagelados, vargulina, y sus análogos sintéticos que se oxidan en presencia de una luciferasa en una reacción que produce bioluminiscencia. 8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que por lo menos uno de entre los ácidos nucleicos de interés y el ácido nucleico complementario está unido a un soporte sólido. 9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el colorante de intercalación se selecciona de entre el grupo constituido por PicoGREEN ® y SYBR GREEN I ® . 10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la detección de la luz es cualitativa. 11. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la detección de la luz es cuantitativa. 12. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha molécula quimioluminiscente es una luciferasa. 13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la luciferasa es una luciferasa de un sistema seleccionado de entre el grupo constituido por los sistemas: Renilla, Gaussia, Pleuromamma, Aequorea, Obelia, Porichthys, Aristostomias, Odontosyllis, Oplophorus, luciérnaga, bacterias, Cavarnularia, Ptilosarcus, Stylatula, Acanthoptilum, Parazoanthus, Chiroteuthis, Eucleoteuthis, Onychoteuthis, Watasenia; sepia, Sepiolina, Sergestes, Gnathophausia; Argyropelecus, Yarella, Diaphus y Neoscopelus. 14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la luciferasa es la luciferasa de Gaussia princeps. 15. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicha molécula quimioluminiscente está asociada a dicha molécula de ácido nucleico complementaria mediante unos medios seleccionados de entre el grupo constituido por interacciones covalentes y no covalentes. 16. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho compuesto quimioluminiscente está asociado a dicho ácido nucleico de interés mediante unos medios seleccionados de entre el grupo constituido por interacciones covalentes y no covalentes. 13 E06784583 14-11-2011   17. Procedimiento que comprende: a) proporcionar una muestra de la que se sospecha que contiene un ácido nucleico de interés; b) poner en contacto la muestra con una molécula de ácido nucleico complementaria al ácido nucleico de interés para formar una doble cadena de ácido nucleico, en el que el ácido nucleico incorpora los nucleótidos marcados con fluorescencia o los análogos de nucleótidos que presentan fluorescencia; c) poner en contacto la muestra con una molécula quimioluminiscente, en el que dicha molécula quimioluminiscente es seleccionada de entre el grupo constituido por la luciferasa, la luciferasa de luciérnaga, la fosfatasa alcalina y la peroxidasa de rábano picante; d) activar la molécula quimioluminiscente mediante la adición de un sustrato quimioluminiscente para producir luz, en el que la luz excita los nucleótidos marcados con fluorescencia o los análogos de nucleótidos que presentan fluorescencia; y e) detectar la luz emitida por los nucleótidos marcados con fluorescencia o los análogos de nucleótidos que presentan fluorescencia, detectándose así un ácido nucleico de interés. 14 E06784583 14-11-2011   E06784583 14-11-2011   16 E06784583 14-11-2011   17 E06784583 14-11-2011   18 E06784583 14-11-2011   19 E06784583 14-11-2011   E06784583 14-11-2011   21 E06784583 14-11-2011   22 E06784583 14-11-2011