Método para amplificar y detectar un ácido nucleico diana, que comprende:

-someter dicho ácido nucleico diana a una reacción de amplificación por PCR en tiempo real en presencia de: - una ADN polimerasa termoestable, -una exonucleasa 3'-5' termoestable dependiente de doble cadena que no es una ADN polimerasa que presente actividad correctora de errores 3'-5', -una pareja de cebadores de amplificación, -desoxinucleósidos trifosfato, -una sonda de hibridación que porta un primer marcaje y un segundo marcaje, -siendo capaz dicho primer marcaje de actuar como entidad informadora fluorescente al excitarse con luz de una longitud de onda apropiada, -siendo capaz dicho segundo marcaje de actuar como entidad extintora de la fluorescencia de dicha entidad informadora fluorescente, caracterizado porque un marcaje se encuentra unido al extremo 3' de dicha sonda de hibridación, y caracterizado porque además el otro marcaje se encuentra unido internamente o en el extremo 5' a dicha sonda de hibridación, caracterizado porque además dicha sonda no participa en el procedimiento de amplificación por medio del cebado de una reacción de polimerización de ADN realizando un seguimiento de la fluorescencia de dicha entidad informadora fluorescente por lo menos después de una pluralidad de ciclos de amplificación, - en la que se crea una señal fluorescente por medio de: la eliminación de una entidad fluorescente 3' de dicha sonda de hibridación que realiza dicha exonucleasa termoestable durante cada ciclo de amplificación

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de la PCR en tiempo real. Más particularmente, la presente invención proporciona un nuevo método para la PCR en tiempo real, se realiza el seguimiento de la amplificación caracterizada de un ADN diana mediante hibridación con una sonda de hibridación fluorescente apropiadamente marcada en combinación con una química específica que proporciona un efecto de PCR de inicio en caliente. Antecedentes de la técnica anterior

La amplificación del ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica fundamental de la biología molecular. El análisis de los ácidos nucleicos mediante PCR requiere la preparación de la muestra, la amplificación y el análisis del producto. Aunque estas etapas habitualmente se llevan a cabo secuencialmente, la amplificación y el análisis pueden producirse simultáneamente. Pueden añadirse pigmentos de ADN o sondas fluorescentes a la mezcla de PCR antes de la amplificación y utilizarse para analizar los productos de PCR durante la misma. El análisis de la muestra se realiza concurrentemente a la amplificación en el mismo tubo dentro del mismo instrumento. Este enfoque combinado reduce la manipulación de la muestra, ahorra tiempo y reduce en gran medida el riesgo de contaminación del producto para reacciones

posteriores, debido a que no existe necesidad de extraer las muestras de los recipientes cerrados para el análisis posterior. El concepto de combinar la amplificación con el análisis de producto se ha venido a denominar PCR "en tiempo real" (ver, por ejemplo, la patente US nº 6.174.670).

Formatos de detección de PCR en tiempo real

En la PCR en tiempo real cinética, se realiza el seguimiento de los productos de PCR en cada ciclo de la misma. La amplificación habitualmente se mide en termocicladores que presentan dispositivos adicionales para medir las señales de fluorescencia durante la reacción de amplificación. a) Formato de pigmento ligante de ADN

Debido a que la cantidad de producto de amplificación de doble cadena habitualmente excede la cantidad de ácido nucleico originalmente presente en la muestra que debe analizarse, pueden utilizarse pigmentos específicos de ADN de doble cadena, que tras la excitación con una longitud de onda apropiada muestran una fluorescencia incrementada únicamente en el caso de que se encuentren unidos a ADN de doble cadena. Preferentemente pueden utilizarse únicamente aquellos pigmentos que, tal como SybrGreenI, por ejemplo, no afecten a la eficiencia de la reacción de PCR.

Todos los demás formatos conocidos de la técnica

b) Balizas moleculares

Dichas sondas de hibridación también se marcan con un primer componente y con un extintor, encontrándose los marcajes situados preferentemente en ambos extremos de la sonda. Como resultado de la estructura secundaria de la sonda, ambos componentes se encuentran en vecindad espacial en solución. Tras la hibridación a los ácidos nucleicos diana, ambos componentes se separan uno de otro de manera que, tras la excitación con luz de una longitud de onda adecuada, puede medirse la emisión de fluorescencia del primer componente (patente US nº 5.118.801). c) Sondas de hibridación FRET

La forma de ensayo de sonda de hibridación FRET resulta especialmente útil para todos los tipos de ensayo de hibridación homogénea (Matthews J.A. y Kricka L.J., Analytical Biochemistry 169:1-25, 169). Se caracteriza por dos sondas de hibridación de una cadena que se utilizan simultáneamente y que son complementarios a sitios contiguos de la misma cadena del ácido nucleico diana amplificado. Ambas sondas se marcan con diferentes componentes fluorescentes. Al excitarse con luz de una longitud de onda adecuada, un primer componente transfiere la energía absorbida al segundo componente según el principio de transferencia energética por resonancia de fluorescencia, de manera que puede medirse una emisión de fluorescencia del segundo componente al unirse ambas sondas de hibridación a posiciones contiguas de la molécula diana que debe detectarse. Alternativamente al seguimiento del incremento de la fluorescencia del componente aceptor de FRET, también

resulta posible realizar el seguimiento de la reducción de

la fluorescencia del componente donante FRET a modo de medición cuantitativa de los sucesos de hibridación.

En particular, el formato de sonda de hibridación FRET puede utilizarse en la PCR en tiempo real con el fin de detectar el ADN diana amplificado. Entre todos los formatos de detección conocidos de la técnica de PCR en tiempo real, se ha demostrado que el formato de sonda de hibridación FRET es altamente sensible, preciso y fiable (patentes WO nº 97/46707, nº 97/46712 y nº 97/46714). A modo de alternativa a la utilización de un cebador marcado fluorescentemente, también resulta posible utilizar un cebador marcado fluorescentemente y únicamente una sola sonda oligonucleótida marcada (Bernard P.S. et al., Analytical Biochemistry 255:101-107, 1998). A este respecto, puede seleccionarse arbitrariamente si el cebador se marca con el donador de FRET o con el compuesto aceptor de FRET. d) Formato de sonda de marcaje único (SLP)

Este formato de detección consiste de un único oligonucleótido marcado con un único pigmento fluorescente en el extremo 5' ó 3' (patente WO nº 02/14555). Pueden utilizarse dos diseños diferentes para el marcaje de oligos: sondas G-Quenching y sondas nitroindol-desatenuantes. En la realización de G-Quenching, el pigmento fluorescente se une a un C en el extremo 5' ó 3' del oligo. La fluorescencia se reduce significativamente al hibridarse la sonda con la diana, en el caso de que se encuentren dos G en la cadena diana delante de Cs y en la posición 1 aparte de la sonda oligonucleótida complementaria. En la realización de

nitronindol-desatenuantes, el pigmento fluorescente se une a

nitroindol en el extremo 5' ó 3' del oligonucleótido. El nitroindol en cierta manera reduce la señalización fluorescente de la sonda libre. Se incrementa la fluorescencia al hibridarse la sonda al ADN diana debido a un efecto de desatenuación. e) Sonda TaqMan

Se marca con dos componentes una sonda de hibridación de una cadena. Al excitar el primer componente con luz de una longitud de onda adecuada, se transfiere la energía absorbida al segundo componente, el denominado extintor, según el principio de transferencia energética por resonancia de fluorescencia. Durante la etapa de hibridación de la reacción de PCR, la sonda de hibridación se une al ADN diana y es degradado por la actividad 5'-3' exonucleasa de la polimerasa Taq durante la etapa de alargamiento posterior. Como resultado, el componente fluorescente excitado y el extintor se encuentra separados espacialmente uno de otro y, de esta manera, puede medirse una emisión de fluorescencia del primer componente. Los ensayos de sonda TaqMan se dan a conocer en detalle en las patentes US nº 5.210.015, nº 5.538.848 y nº 5.487.972. Las sondas de hibridación TaqMan y mezclas de reactivos se dan a conocer en la patente US nº 5.804.375. f) Formatos de liberación

Además, recientemente se han dado a conocer dos otros formatos restringidos a la detección específica de alelo que se basan en el principio de detección específica de una liberación de un nucleótido 3'-terminal marcado debido a una

situación de correspondencia o no correspondencia con

respecto a su unión al ácido nucleico diana. La patente US nº 6.391.551 da a conocer un método caracterizado porque el nucleótido 3'-terminal de una sonda de hibridación resulta liberado por un enzima despolimerizador en el caso de que se haya producido una correspondencia perfecta entre la secuencia diana y la sonda. De manera similar, la patente EP nº 0 930 370 sugiere la utilización de un cebador marcado con un informador y con un grupo extintor, caracterizado porque una actividad de corrección de errores 3'-5' elimina un grupo en el caso de que se haya producido una correspondencia no perfecta entre el cebador y la diana de amplificación. Enzimología de la PCR

La síntesis de ácidos nucleicos in vitro se lleva a cabo rutinariamente con ADN polimerasas con o sin polipéptidos adicionales. Las ADN polimerasas son una familia de enzimas implicada en la replicación y reparación del ADN. Se ha llevado a cabo investigación...

1. Método para amplificar y detectar un ácido nucleico

diana, que comprende: -someter dicho ácido nucleico diana a una reacción de amplificación por PCR en tiempo real en presencia de:

- una ADN polimerasa termoestable, -una exonucleasa 3'-5' termoestable dependiente de doble cadena que no es una ADN polimerasa que presente actividad correctora de errores 3'-5', -una pareja de cebadores de amplificación, -desoxinucleósidos trifosfato, -una sonda de hibridación que porta un primer marcaje y un segundo marcaje, -siendo capaz dicho primer marcaje de actuar como entidad informadora fluorescente al excitarse con luz de una longitud de onda apropiada, -siendo capaz dicho segundo marcaje de actuar como entidad extintora de la fluorescencia de dicha entidad informadora fluorescente, caracterizado porque un marcaje se encuentra unido al extremo 3' de dicha sonda de hibridación, y caracterizado porque además el otro marcaje se encuentra unido internamente

o en el extremo 5' a dicha sonda de hibridación,

caracterizado porque además dicha sonda no

participa en el procedimiento de

amplificación por medio del cebado de una

reacción de polimerización de ADN

realizando un seguimiento de la fluorescencia

de dicha entidad informadora fluorescente por

lo menos después de una pluralidad de ciclos

de amplificación,

- en la que se crea una señal fluorescente

por medio de:

la eliminación de una entidad fluorescente 3' de dicha sonda de hibridación que realiza dicha exonucleasa termoestable durante cada ciclo de amplificación.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha entidad informadora se encuentra en el extremo 3' de dicha sonda de hibridación.

3. Método según las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho marcaje unido al residuo nucleótido 3'-terminal de dicha sonda de hibridación se encuentra unido a dicho oligonucleótido mediante un grupo fosfato.

4. Método según las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha exonucleasa 3'-5' dependiente de doble cadena se selecciona de entre un grupo que consiste de exonucleasa III y exonucleasa IV.

5. Método según las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho segundo marcaje se encuentra unido a una base de un residuo de dicha sonda de hibridación.

6. Método según las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho segundo marcaje se une a un elemento abásico de dicha sonda de hibridación.