APARATO PARA LLEVAR A CABO LA PCR Y MONITORIZACIÓN DE LA REACCIÓN EN TIEMPO REAL DURANTE CICLOS DE TEMPERATURA.

Aparato para llevar a cabo la PCR y control de la reacción en tiempo real durante los ciclos de temperatura que comprende:

una serie de recipientes para muestras cada uno de los cuales contiene una muestra para la PCR, comprendiendo cada recipiente de muestras un material transparente ópticamente y estando configurado para contener menos de 1 mililitro de una muestra; un carrusel rotativo para posicionar secuencialmente los recipientes de muestras para la PCR en una posición de control de manera que el carrusel es obligado a girar de forma continua durante la totalidad de la PCR; medios para la realización de ciclos térmicos que comprenden un calentador de aire forzado para calentar simultáneamente todas las muestras de la PCR del carrusel; y medios para enfriar simultáneamente todas las muestras de la PCR del carrusel; medios de control para accionar de manera repetida los medios de realización de ciclos térmicos para someter las muestras de la PCR a ciclos térmicos; medios para excitar ópticamente una de las muestras para provocar que la muestra emita florescencia; y medios para detectar la fluorescencia de la muestra excitada cuando dicha muestra excitada se encuentra en la posición de control

ANTECEDENTES

1. Sector técnico al que pertenece la invención

La presente invención se refiere de modo general a aparatos que se utilizan para llevar a cabo procesos biológicos, tales como la reacción de la cadena de polimerasa. De manera más específica, la presente 5 invención se refiere a aparatos que llevan a cabo el ciclo térmico y la supervisión de diferentes reacciones biológicas, tales como la reacción de la cadena de polimerasa.

2. Antecedentes técnicos

En numerosas áreas industriales, de la tecnología y de la investigación existe la necesidad de someter de manera fiable y reproducible ciertas muestras a un ciclo térmico. La necesidad de someter una muestra 10 a ciclos térmicos repetidos es particularmente aguda en aplicaciones de biotecnología. En el sector de la biotecnología, es deseable frecuentemente calentar y enfriar repetidamente pequeñas muestras de materiales a lo largo de un corto período de tiempo. Uno de los procesos biológicos que es llevado a cabo regularmente es la amplificación cíclica de ADN.

La amplificación cíclica de ADN utilizando polimerasa de ADN termoestable permite una 15 amplificación automatizada del cebador específico de ADN, conocido ampliamente como “reacción de la cadena de polimerasa” o “PCR”. La automatización de este procedimiento requiere un ciclo térmico preciso y controlado de las mezclas de reacción usualmente contenidas en una serie de contenedores. Con anterioridad, el contenedor preferente ha sido un tubo micrófugo estándar de material plástico.

Se han utilizado bloques térmicos, metálicos, programables de tipo comercial con anterioridad 20 para llevar a cabo el ciclo de temperatura de muestras en tubos micrófugos según la variación deseada de temperatura con respecto al tiempo. No obstante, la imposibilidad de ajustar de manera rápida y exacta la temperatura de los bloques térmicos en una amplia gama de temperaturas en un corto período de tiempo, ha hecho poco deseable la utilización de dispositivos del tipo de bloques térmicos como sistema de control térmico cuando se llevan a cabo procesos tales como reacción de la cadena de polimerasa. 25

Además, los tubos micrófugos que se han utilizado de modo general tienen desventajas. El material de los tubos micrófugos, su grosor de paredes y la geometría de tubos micrófugos es un inconveniente para el calentamiento y enfriamiento rápidos de las muestras contenidas en los mismos. El material plástico y el grosor de pared de los tubos micrófugos actúan como aislante entre la muestra contenida y el medio circundante dificultando por esta razón la transferencia de energía térmica. Asimismo, la geometría del tubo micrófugo presenta una pequeña 30 área superficial a cualquiera de los medios utilizados para la transferencia de la energía térmica. La utilización continuada de tubos micrófugos en esta técnica, con su geometría que no es óptima, indica que las ventajas de la transferencia térmica mejorada (que se consiguen al aumentar el área superficial de un contenedor de muestras para una muestra de volumen constante) no se han reconocido hasta el momento.

Además, también se han utilizado dispositivos que utilizan baños de agua con conmutación 35 fluídica (o transferencia mecánica) como dispositivo de ciclo térmico para la reacción de cadena de polimerasa. Si bien se han utilizado baños de agua en el ciclo de la mezcla de reacción de la cadena de polimerasa de acuerdo con una variación deseada de temperatura con respecto al tiempo necesario para que tenga lugar la reacción, la elevada masa térmica del agua (y la baja conductividad térmica de los tubos micrófugos de plástico) ha sido un aspecto significativamente limitativo en cuanto al comportamiento del aparato y a la especificidad de la reacción. 40

Los dispositivos que utilizan baños de agua tienen un rendimiento limitado. La causa de ello es que la masa térmica del agua restringe significativamente el gradiente de temperatura máxima con respecto al tiempo que se puede alcanzar. Asimismo, el aparato con baño de agua se ha observado que es muy engorroso debido a las dimensiones y número de tubos portadores de agua y dispositivos externos de control de temperatura del agua. Además, la necesidad de excesivo mantenimiento periódico e inspección de los racores para el agua a 45 efectos de detectar fugas en aparatos con baño de agua es dificultosa y requiere mucho tiempo. Finalmente, es difícil con aparatos con baño de agua controlar la temperatura en los tubos de muestra con la exactitud que sería de desear.

La Patente U.S.A. Nº 3.616.264 de Ray muestra un aparato térmico de aire forzado destinado a efectuar el ciclo del aire para calentar o enfriar muestras biológicas a una temperatura constante. Si bien el 50 dispositivo de Ray es más o menos eficaz en el mantenimiento de una temperatura constante dentro de la cámara de aire, no se adapta a la necesidad de ajustar rápidamente la temperatura de forma cíclica de acuerdo con la variación de temperatura con respecto al tiempo requerida para procesos biológicos tales como la reacción de la cadena de polimerasa.

Las Patentes U.S.A. Nº 4.420.679 de Howe y Nº 4.286.456 de Sisti y otros dan a conocer estufas 55 cromatográficas de gas. Los dispositivos que se dan a conocer en dichas patentes Howe y Sisti y otros son adecuados para llevar a cabo procedimientos de cromatografía gaseosa pero no proporcionan capacidad de

realización de ciclos térmicos que sea significativamente más rápida que lo que se consigue por cualquiera de los dispositivos que se han descrito. La realización de ciclos térmicos rápidos es útil para llevar a cabo muchos procedimientos. Dispositivos tales como los que se describen en dichas patentes Howe y Sisti y otros no son adecuados para llevar a cabo de manera rápida y eficaz las mencionadas reacciones.

En particular, la reacción de cadena de polimerasa (PRC) es una técnica de amplificación 5 fundamental de ADN esencial en la biología molecular moderna. A pesar de su carácter útil y su popularidad, el conocimiento actual de la PCR no es muy avanzado. Se deben optimizar las amplificaciones por pruebas sucesivas y los protocolos son seguidos frecuentemente de forma ciega. La comprensión limitada de la PCR de la técnica actual es un buen ejemplo de la forma en la que los actuales técnicos en la materia se conforman en utilizar una técnica potente sin reflexión ni comprensión. 10

Los procesos biológicos tales como la PCR requieren la realización de ciclos de temperatura con la muestra. La técnica anterior, tal como se ha explicado anteriormente, no solamente lleva a cabo los ciclos de temperatura lentamente, sino que ignora los principios que subyacen y que permiten el funcionamiento de la PCR y que se podrían utilizar para hacer la PCR incluso más potente. Así por ejemplo, sería un gran progreso en esta técnica el dar a conocer métodos y aparatos que son particularmente adaptables para llevar a cabo rápidamente la 15 PCR y para el análisis de la reacción que está teniendo lugar, especialmente si dicha reacción es analizada mientras está teniendo lugar, es decir, en tiempo real.

BREVE RESUMEN Y OBJETIVOS DE LA INVENCIÓN

Teniendo en cuenta el estado de la técnica anteriormente descrita, la presente invención está destinada a conseguir los siguientes objetivos y ventajas. 20

Es un objetivo de la presente invención dar a conocer un aparato para controlar de manera precisa la temperatura de muestras biológicas.

Es otro objetivo de la presente invención dar a conocer un aparato para realizar ciclos térmicos para variar de manera rápida y exacta la temperatura de muestras biológicas de acuerdo con una variación predeterminada de la temperatura con respecto al tiempo. 25

Otro objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer un aparato adecuado para someter una serie de muestras biológicas distintas a ciclos térmicos rápidos.

También se describe la forma de conseguir un aparato para la realización de ciclos térmicos que tiene un medio de transferencia térmica con baja masa térmica que puede someter de manera efectiva unas muestras a un fuerte gradiente de temperatura durante un período de tiempo muy corto. 30

Es otro objetivo de la presente invención dar a conocer un aparato que puede someter una muestra biológica a ciclos térmicos rápidos utilizando aire como medio de transferencia térmica.

Es...

1. Aparato para llevar a cabo la PCR y control de la reacción en tiempo real durante los ciclos de temperatura que comprende:

una serie de recipientes para muestras cada uno de los cuales contiene una muestra para la PCR, comprendiendo cada recipiente de muestras un material transparente ópticamente y estando configurado 5 para contener menos de 1 mililitro de una muestra;

un carrusel rotativo para posicionar secuencialmente los recipientes de muestras para la PCR en una posición de control de manera que el carrusel es obligado a girar de forma continua durante la totalidad de la PCR;

medios para la realización de ciclos térmicos que comprenden 10

un calentador de aire forzado para calentar simultáneamente todas las muestras de la PCR del carrusel; y

medios para enfriar simultáneamente todas las muestras de la PCR del carrusel;

medios de control para accionar de manera repetida los medios de realización de ciclos térmicos para someter las muestras de la PCR a ciclos térmicos;

medios para excitar ópticamente una de las muestras para provocar que la muestra emita florescencia; y 15

medios para detectar la fluorescencia de la muestra excitada cuando dicha muestra excitada se encuentra en la posición de control.

2. Aparato para llevar a cabo la PCR y el control de la reacción durante los ciclos de temperatura, según la reivindicación 1, en el que los recipientes de muestras son fabricados a base de cristal.

3. Aparato para llevar a cabo la PCR y el control de la reacción durante los ciclos de 20 temperatura, según la reivindicación 1, que comprende además medios para posicionar los medios para excitar ópticamente la muestra y los medios para detectar la fluorescencia de la muestra excitada para optimizar la fluorescencia detectada.

4. Aparato para llevar a cabo la PCR y el control de la reacción durante los ciclos de temperatura, según la reivindicación 1, en el que los medios de enfriamiento comprenden un mecanismo de 25 movimiento del aire que transporta aire ambiente a los recipientes de las muestras.

5. Aparato para llevar a cabo la PCR y el control de la reacción durante los ciclos de temperatura, según la reivindicación 1, en el que los medios de control comprenden un microprocesador.

6. Aparato para llevar a cabo la PCR y el control de la reacción durante los ciclos de temperatura, según la reivindicación 1, en el que los medios para excitar ópticamente la muestra comprenden una 30 estructura fotoemisora dispuesta de manera que la fluorescencia emitida por la misma choca en un lateral del recipiente de las muestras.

7. Aparato para llevar a cabo la PCR y el control de la reacción durante los ciclos de temperatura, según la reivindicación 6, en el que los medios para detectar la fluorescencia de la muestra excitada comprenden una estructura fotodetectora dispuesta de manera que se detecta la fluorescencia emitida desde el 35 lateral del recipiente de las muestras.

8. Aparato para llevar a cabo la PCR y el control de la reacción durante los ciclos de temperatura, según la reivindicación 1, en el que la proporción del volumen al área superficial externa de los recipientes de las muestras es menor de 1mm3/mm2.

9. Aparato para llevar a cabo la PCR y el control de la reacción durante los ciclos de 40 temperatura, según la reivindicación 1, en el que los medios de enfriamiento simultáneo consisten en un ventilador.

10. Aparato para llevar a cabo la PCR y el control de la reacción durante los ciclos de temperatura, según la reivindicación 9, en el que el carrusel está montado en una cámara y el dispositivo de calentamiento y el ventilador se encuentran en comunicación de flujo de aire con dicha cámara.