Método de ensayo de detección para un procedimiento de PCR que utiliza FRET,

comprendiendo el método las etapas de proporcionar una primera secuencia oligonucleótida de marcaje único y por lo menos una segunda secuencia oligonucleótida de marcaje único, siendo la primera y segunda secuencias oligonucleótidas de diferente Tm, en donde la primera y segunda secuencias oligonucleótidas se hibridan entre sí en solución libre, formando una pareja fluorescente desactivada, proporcionado por lo menos un cebador e iniciando la PCR, generando de esta manera una secuencia complementaria a una o a ambas secuencias, presentando una de entre la primera y segunda secuencias oligonucleótidas una Tm inferior a la Ta del procedimiento de PCR, caracterizado porque la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único consiste de una secuencia oligonucleótida que presenta un único marcaje en un extremo, comprendiendo el cebador o cebadores por lo menos un cebador con cola no marcado, presentando el cebador con cola no marcado una región de cola, comprendiendo la región de cola una secuencia oligonucleótida idéntica a una secuencia oligonucleótida de la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único, siendo la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único un cebador a partir del que se inicia la síntesis de ADN tras generarse una secuencia complementaria a la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único durante el procedimiento de PCR, de manera que la segunda secuencia oligonucleótida de marcaje único ya no puede hibridarse con la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único, generando una señal medible

Sistema de detección para ensayo de PCR.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo sistema de detección basado en la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET), adecuado para la utilización en ensayos de reacción en cadena de polimerasa.

Antecedentes de la invención

El descubrimiento de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) ha revolucionado el campo de la biología molecular, permitiendo la amplificación de cualquier segmento deseado de ADN de cualquier organismo.

Se realiza un uso más especializado de la PCR en las áreas de la cuantificación en tiempo real y de la determinación de punto final de genotipos, en las que se utilizan sistemas de ensayo homogéneos. Un sistema de ensayo homogéneo es un sistema en el que la obtención del resultado de la reacción no requiere la separación física mutua de los componentes de reacción. En otras palabras, la reacción se lleva a cabo y se obtienen los resultados sin intervención física adicional en la reacción.

Durante la monitorización en tiempo real (en otras palabras, la monitorización de la producción de producto en cada ciclo durante el procedimiento de la PCR), la PCR puede utilizarse de un modo cuantitativo. Esto presenta una amplia aplicación en muchos campos, desde el diagnóstico de infecciones víricas hasta la determinación de la abundancia de una especie de ARN mensajero dentro del ARN humano. El procedimiento físico de monitorización de la PCR en tiempo real es complejo, debido a que requiere instrumentación sofisticada que ha sido diseñada específicamente para el procedimiento. Esta instrumentación requiere que el procedimiento de PCR produzca una cantidad medible de luz que se incremente con cada ciclo hasta agotar los componentes de la reacción. Con este fin se han demostrado y explotado comercialmente varios enfoques elegantes. Dos ejemplos de ellos son el ensayo de la nucleasa 5' Taqman, comercializado por Applied Biosystems (USA), y la reacción de detección con verde SYBR, comercializada por Molecular Probes (Países Bajos). Ambos sistemas de PCR cuantitativa funcionan bien, aunque ambos presentan desventajas que resultaría ventajoso superar.

El genotipado (en particular el genotipado de polimorfismos de nucleótido único (SNP)), por otra parte, es un procedimiento menos exigente con la instrumentación. El procedimiento es esencialmente el mismo, en el que se utiliza un sistema de ensayo homogéneo, aunque el requisito de monitorización de los productos de reacción en cada ciclo de la PCR resulta menos crítico. En efecto, la mayoría de científicos que llevan a cabo un genotipado SNP utilizando sistemas basados en la fluorescencia llevan a cabo la PCR y únicamente al final de la reacción determinan los niveles de producto producido. Esto se denomina de manera general análisis de punto final. El genotipado SNP presenta un nivel adicional de complejidad, en el aspecto de que el propósito de la reacción es determinar el genotipo individual de ADN en un único locus dentro del genoma. Los SNPs son marcadores bialélicos que resultan idóneos para su determinación en gran número a bajo coste en ensayos homogéneos fluorescentes. Los diversos sistemas de reacción utilizados actualmente son, nuevamente, la reacción Taqman (Applied Biosystems), el sistema Amplifluor (Serologicals, USA) y el sistema Scorpions (DxS, Reino Unido). Todos son sistemas de reacción elegantes que producen datos de buena calidad, aunque cada uno de ellos presenta sus propias desventajas.

El principio de todos los sistemas de ensayo homogéneos es la utilización del procedimiento físico de la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) para detectar la producción de producto en el procedimiento de la PCR. FRET es el procedimiento en el que, al hallarse dos fluoróforos suficientemente próximos entre sí, se produce un intercambio de transferencia energética entre los mismos al ser excitados por luz a longitudes de onda correspondientes a su longitud de onda de excitación particular. La técnica FRET resulta idealmente adecuada para la cuantificación de la PCR, debido a que permite monitorizar la reacción sin realizar ninguna separación, un procedimiento que resultaría imposible considerando que, en general, se llevan a cabo 40 ciclos de PCR, y que la cantidad de producto debe determinarse después de cada ciclo.

Las técnicas principales utilizadas actualmente funcionan bien pero adolecen de varias desventajas que dificultan su utilización en el mundo científico.

El ensayo Taqman de Applied Biosystems tal como se comenta en, por ejemplo, la patente US nº 5.538.848 (o, más generalmente, un ensayo de 5' nucleasa basado en FRET), requiere la producción de una sonda oligonucleótida de doble marcaje para cada secuencia de ADN que debe medirse. Se hace referencia a esta sonda en su estado previo a la reacción como "desactivada". En otras palabras, dos fluoróforos (o un desactivador no fluorescente y un fluoróforo) se unen a un oligonucleótido corto separados por una distancia entre ellos inferior a 30 nucleótidos. Esta distancia es suficientemente reducida para que, al excitarse uno de los fluoróforos en su longitud de onda óptima, el otro fluoróforo absorbe la energía absorbida y emite luz a una longitud de onda diferente, o en el caso de un desactivador no fluorescente, la energía absorbida es transferida por FRET al desactivador no fluorescente y no se emite luz. En el caso de que esta molécula se encuentre incluida en la reacción, el procedimiento de PCR crea un ADN complementario a la misma. Esto permite que la sonda se una al ADN, siendo posteriormente destruido por la actividad 5' nucleasa de la polimerasa Taq utilizada en el procedimiento de la PCR. Tras la degradación de la sonda, las dos parejas de fluoróforos ya no se encuentran suficientemente próximos para experimentar la FRET y se crea una diferencia medible de luz.

La desventaja principal del ensayo Taqman es la necesidad de producir sondas oligonucleótidas de marcaje doble. Se requiere una única sonda para las mediciones cuantitativas de la masa del ADN, mientras que se requieren dos para el genotipado SNP (una para cada alelo). La producción de la sonda misma es un procedimiento caro y laborioso. En la actualidad cada sonda puede costar hasta 250 libras esterlinas, proporcionando suficiente reactivo para sólo unos cuantos miles de reacciones. Si se considera que en un proyecto de genotipado SNP pueden estudiarse más de 200 SNPs, el proyecto requeriría una inversión inicial de 10.000 libras esterlinas para la producción de sondas. Ésta es una suma prohibitiva para muchas organizaciones científicas y, de esta manera, supone una desventaja importante del sistema.

En el área de la expresión génica cuantitativa, con frecuencia se utiliza verde SYBR como alternativa de bajo coste a la utilización de Taqman. El verde SYBR es un pigmento interquelante que únicamente se une a ADN bicatenario. De esta manera, puede utilizarse en ensayos homogéneos de PCR cuantitativa. El producto de la PCR se genera a medida que se incrementa el número de ciclos de reacción, y a medida que se acumula producto, el verde SYBR se une al mismo. Tras unirse, el verde SYBR experimenta un cambio de conformación y emite fluorescencia, que se mide directamente. Las dos desventajas principales de la utilización de esta técnica son la naturaleza no específica de la reacción, y que cualquier producto, sea el producto correcto o no, producirá una señal. Por lo tanto, resulta imperativo confirmar que la PCR produce el amplicón que se requiere medir. Taqman no adolece de esta desventaja, debido a que la sonda interacciona únicamente con la secuencia del amplicón correctamente generado. En segundo lugar, la utilización de verde SYBR es conocido que resulta difícil de optimizar, debido a que el verde SYBR mismo puede interaccionar con el procedimiento de la PCR, dificultando la optimización de la reacción.

Los sistemas homogéneos de ensayo PCR Amplifluor y Scorpion también adolecen de desventajas similares. Ambos sistemas utilizan un cebador de PCR con cola para interaccionar con un cebador fluorescente desactivado con una horquilla. En otras palabras, la reacción de PCR se inicia con cebadores oligonucleótidos convencionales de entre los que uno (o dos en el caso del genotipado SNP basado en una PCR específica de alelo) contiene una secuencia que es idéntica al extremo 3' de los cebadores fluorescentes Amplifluor o Scorpion. A continuación, se sintetiza el complemento inverso de dicha secuencia, durante los primeros pocos ciclos de la reacción de PCR. Esto permite que seguidamente los cebadores...

1. Método de ensayo de detección para un procedimiento de PCR que utiliza FRET, comprendiendo el método las etapas de proporcionar una primera secuencia oligonucleótida de marcaje único y por lo menos una segunda secuencia oligonucleótida de marcaje único, siendo la primera y segunda secuencias oligonucleótidas de diferente Tm, en donde la primera y segunda secuencias oligonucleótidas se hibridan entre sí en solución libre, formando una pareja fluorescente desactivada, proporcionado por lo menos un cebador e iniciando la PCR, generando de esta manera una secuencia complementaria a una o a ambas secuencias, presentando una de entre la primera y segunda secuencias oligonucleótidas una Tm inferior a la Ta del procedimiento de PCR, caracterizado porque la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único consiste de una secuencia oligonucleótida que presenta un único marcaje en un extremo, comprendiendo el cebador o cebadores por lo menos un cebador con cola no marcado, presentando el cebador con cola no marcado una región de cola, comprendiendo la región de cola una secuencia oligonucleótida idéntica a una secuencia oligonucleótida de la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único, siendo la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único un cebador a partir del que se inicia la síntesis de ADN tras generarse una secuencia complementaria a la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único durante el procedimiento de PCR, de manera que la segunda secuencia oligonucleótida de marcaje único ya no puede hibridarse con la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único, generando una señal medible.

2. Método de detección según la reivindicación 1, en el que la primera y segunda secuencias oligonucleótidas de marcaje único consisten de una secuencia oligonucleótida marcada fluorescentemente y la otra secuencia oligonucleótida de marcaje único consiste de una secuencia oligonucleótida marcada con un desactivador.

3. Método de detección según la reivindicación 1, incorporado en un sistema de PCR para detectar una secuencia específica, en el que dichas primera secuencia oligonucleótida de marcaje único y segunda secuencia oligonucleótida de marcaje único presentan longitudes que difieren en más de 10 bases.

4. Método de detección según la reivindicación 1, en el que el procedimiento de PCR se monitoriza en tiempo real en cada ciclo o tras un número de ciclos con los que la reacción no ha generado todavía suficiente producto para crear una señal medible mediante la reducción de la temperatura de reacción para permitir que se produzca la hibridación.

5. Método de detección según la reivindicación 1, en el que dicha primera secuencia presenta una Tm que es superior a la Ta del procedimiento de PCR.

6. Método de detección según la reivindicación 1, en el que dicha segunda secuencia presenta el marcaje desactivador de la pareja fluorescente desactivada.

7. Método de detección según la reivindicación 1, en el que el procedimiento de PCR es el genotipado SNP basado en la PCR específica de alelo.

8. Método de detección según la reivindicación 1, en el que el procedimiento de PCR se monitoriza mediante la utilización de únicamente hibridación.

9. Método de detección según la reivindicación 8, en el que el procedimiento de PCR se monitoriza mediante la utilización posteriormente a la PCR de únicamente hibridación.

10. Método de detección según la reivindicación 1, en el que las parejas de oligos de desactivación de fluorescencia presentan una longitud comprendida entre 6 pb y 100 pb.

11. Método de detección según la reivindicación 10, en el que las parejas de oligos de desactivación de fluorescencia presentan una longitud comprendida entre 6 pb y 100 pb pero no presentan la misma longitud.

12. Método de detección según la reivindicación 1, en el que ambos elementos de las parejas de oligos de desactivación de fluorescencia se marcan con fluoróforos.

13. Método de detección según la reivindicación 1, en el que en las parejas de oligos de desactivación de fluorescencia, un elemento de la pareja se marca con un fluoróforo y el otro elemento, con una molécula desactivadora no fluorescente.

14. Método de detección según la reivindicación 1, en el que las parejas de oligos de desactivación de fluorescencia se modifican para que sean resistentes a la degradación por nucleasas.

15. Método de detección según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las parejas de oligos de desactivación de fluorescencia se marcan con moléculas que son sensibles a la distancia.

16. Método de detección según la reivindicación 15, en el que el procedimiento de PCR se monitoriza mediante la utilización de únicamente hibridación.

17. Método de detección según la reivindicación 1, en el que las parejas de oligos de desactivación de fluorescencia contienen bases nucleótidas modificadas.