PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCIÓN DE MÚLTIPLES ANALITOS.

Esta invención se refiere a métodos para detectar más de dos componentes diferentes en un único medio de prueba. El campo del diagnostico clínico ha mostrado una amplia expansión en los últimos años, tanto con respecto a la variedad de materiales de interés que pueden determinarse de manera fácil y precisa, así como a los métodos para la determinación. Se desean medios convenientes, fiables y no peligrosos para detectar la presencia de bajas concentraciones de materiales en líquidos. En química clínica, estos materiales pueden estar presentes en fluidos corporales en concentraciones por debajo de 10 -12 molar. La dificultad de detectar bajas concentraciones de estos materiales se potencia por los tamaños de muestra relativamente pequeños que pueden utilizarse. La necesidad de determinar múltiples analitos en la sangre y otros fluidos biológicos resulta cada vez más evidente en muchas ramas de la medicina. En endocrinología, se requiere a menudo el conocimiento de la concentración plasmática de varias hormonas diferentes para solucionar un problema de diagnostico o un panel de marcadores para un diagnóstico dado en el que las razones pueden ayudar en la determinación de la evolución de la enfermedad. Es evidente una necesidad incluso más urgente en otras áreas tales como pruebas de alergia, el examen de sangre transfundida para determinar la contaminación viral o el diagnóstico genético. Uno cualquiera de varios agentes infecciosos puede provocar algunos estados de enfermedad patológicos. En otros casos, el diagnóstico y la evaluación de los estados de enfermedad pueden evaluarse mejor mediante la medición de varios analitos en una muestra, tal como un panel de citocinas y quimiocinas, un panel de marcadores de enfermedad específicos de tejido, un panel de antígenos y anticuerpos de diagnóstico y similares. Otro ejemplo de la utilidad del análisis simultáneo de múltiples analitos es la determinación del nivel de expresión de un panel de genes en una población de células dada o la detección y cuantificación simultanea de múltiples secuencias de ácido nucleico en una muestra individual. Otros beneficios de la detección y cuantificación simultánea de múltiples analitos son el posible aumento en el rendimiento del análisis y la capacidad de incorporar controles internos para la muestra de prueba. En otros ensayos tales como ensayos de hibridación de ácido nucleico, existe la necesidad de detectar y cuantificar una secuencia control positiva y diana específica en un único tubo sin etapas de transferencia y separaciones que llevan mucho tiempo. En principio, los controles internos eliminarán la necesidad de una curva patrón. La amplificación y detección en un único tubo sin abrir el tubo también supera los problemas de contaminación. En el análisis de mutación, la capacidad de medir dos o más variantes en un único tubo permitiría monitorizar cuantitativamente la aparición de poblaciones mutantes. La mayoría de los ensayos de múltiples analitos son heterogéneos, tienen escasa sensibilidad y un rango dinámico escaso (se determina una diferencia de 2 a 100 veces en la concentración de los analitos) y algunos requieren el uso de instrumentación sofisticada. Un ensayo homogéneo que tenga sensibilidad superior, rango dinámico grande (diferencia de 10 3 a 10 4 veces en la concentración de analito) y menos reactivos y más estables podría aumentar la simplicidad y fiabilidad o ensayos de múltiples analitos. Los compuestos luminiscentes, tales como compuestos fluorescentes y compuestos quimioluminiscentes, encuentran amplia aplicación en el campo de ensayo debido a su capacidad para emitir luz. Por este motivo, se han utilizado agentes luminiscentes como marcadores en ensayos tales como inmunoensayos y ensayos de ácido nucleico. Por ejemplo, un miembro de un par de unión específica se conjuga con un agente luminiscente y se emplean diversos protocolos. El conjugado de agente luminiscente puede repartirse entre una fase sólida y una fase líquida en relación a la cantidad de analito en una muestra que se sospecha que contiene el analito. Midiendo la luminiscencia de cualquiera de las fases, puede relacionarse el nivel de luminiscencia observada con una concentración del analito en la muestra. Los sistemas anteriormente descritos para la detección y cuantificación simultánea de múltiples analitos en una única muestra o múltiples análisis se basan en múltiples grupos indicadores que corresponden cada uno a un analito específico. Se han usado diversos marcadores para producir señales distinguibles en ensayos de múltiples analitos: (a) dos marcadores de radioisótopos diferentes, (b) dos o más marcadores fluorescentes diferentes, (c) un marcador quimioluminiscente y uno fluorescente, (c) quelatos de lantánido diferentes en los que se miden tanto el tiempo de vida como la longitud de onda, (e) una enzima y un éster de acridinio, (f) resolución espacial de diferentes analitos, (g) diferentes enzimas con adiciones de sustrato secuenciales y (h) diferentes ésteres de acridinio que producen dioxetanonas que tienen diferentes tiempos de vida. 2   En otro enfoque, se emplea un único grupo indicador que reacciona diferencialmente con diversos analitos para producir multiplicidad de señales. Cuando el análisis implica múltiples señales en una única mezcla de reacción, las señales pueden resolverse basándose en la diferencia de longitud de onda y o diferencias en la semivida de emisión. 2. Breve descripción de la técnica relacionada. La patente estadounidense n.º 5.656.207 (Woodhead, et al.) (Woodhead I) da a conocer un método para detectar o cuantificar múltiples analitos usando técnicas de marcaje. Se dan a conocer en las patentes estadounidenses n. os 5.827.656 (Nelson, et al.) (Nelson I) y 5.658.737 (Nelson, et al.) (Nelson II) composiciones y métodos para la detección y cuantificación simultánea de múltiples secuencias de ácido nucleico específicas. La patente estadounidense n.º 5.395.752 (Law, et al.) da a conocer compuestos quimioluminiscentes de larga longitud de onda de emisión y su uso en los ensayos de prueba. Chandler, et al., tratan el análisis multiplexado de muestras clínicas, el aparato y el método en el documento PCT WO 97/14028. Se describe un ensayo multiplexado sensible, rápido para la detección de ácidos nucleicos virales usando el sistema FlowMetrix de Smith, et al., en Clinical Chemistry (1998) 44(9):2054-2056. Narang, et al., trata la detección de múltiples analitos usando un inmunosensor de flujo basado en capilares (Analytical Biochemistry (1998) 255:13-19). Se describe el análisis multiparamétrico rápido de la simulación celular en reacciones de cultivo de linfocitos mixtos por Traganos, et al., en The Journal of Histochemistry and Cytochemistry (1977) 25(7):881-887). La patente estadounidense n.º 5.340.716 (Ullman, et al.) describe un método de ensayo que utiliza marcadores quimioluminiscentes fotoactivados. Se describen en la patente estadounidense n.º 5.709.994 (Pease, et al.) matrices quimioluminiscentes fotoactivables. El documento WO 99/42618 se refiere a un método para detectar la cantidad de un polinucleótido diana (es decir, uno) en una muestra. Clinical Chemistry, vol. 42, n.º 9, 1996, 1518-1526, Luminescent oxygen channeling assay (LOCI): sensitive, broadly applicable homogeneous immunoassay method, documento XP-002109518, da a conocer la detección de un único analito en un medio usando un compuesto quimioluminiscente y un sensibilizador. El documento WO 01/12859, una solicitud anterior, sugiere un método para la detección de una diferencia en un único analito. Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 91, págs. 5426-5430, junio de 1994, Luminescent oxygen channeling immunoassay: Measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence, documento XP-000882828, se refiere a un ensayo que usa un sensibilizador que genera oxígeno singlete y un reactivo quimioluminiscente reactivo que puede activarse mediante el oxígeno singlete. Sumario de la invención Un aspecto de la presente invención es un método para determinar la presencia o las cantidades relativas de más de dos analitos diferentes que se sospecha que están en un medio, comprendiendo dicho método: a) proporcionar en combinación (1) un medio que se sospecha que contiene dichos más de dos analitos diferentes, (2) al menos dos reactivos sensibilizadores, pudiendo dichos reactivos sensibilizadores generar oxígeno singlete y pudiendo distinguirse entre sí mediante longitud de onda de sensibilización, y (3) múltiples reactivos que son reactivos que son composiciones quimioluminiscentes y que pueden activarse mediante oxígeno singlete y que pueden detectarse diferencialmente mediante diferentes longitudes de onda de emisión o mediante diferentes razones de descomposición y que están asociados con un miembro... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar la presencia o las cantidades relativas de más de dos analitos diferentes que se sospecha que están en un medio, comprendiendo dicho método: a) proporcionar en combinación (1) un medio que se sospecha que contiene dichos más de dos analitos diferentes, (2) al menos dos reactivos sensibilizadores, pudiendo dichos reactivos sensibilizadores generar oxígeno singlete y pudiendo distinguirse entre sí mediante longitud de onda de sensibilización, y (3) múltiples reactivos que son reactivos que son composiciones quimioluminiscentes y que pueden activarse mediante oxígeno singlete y que pueden detectarse diferencialmente mediante diferentes longitudes de onda de emisión o mediante diferentes razones de descomposición y que están asociados con un miembro sbp que puede unirse con un analito, en el que un primer miembro de par de unión específica (sbp) está asociado con cada uno de dichos reactivos sensibilizadores y en los que, para cada uno de dichos reactivos sensibilizadores, dicho primer miembro sbp puede unirse a un analito respectivo o a un segundo miembro sbp para formar un complejo relacionado con la cantidad de dicho analito, y b) activar diferencialmente dichos reactivos sensibilizadores y detectar la cantidad de señal generada como resultado de la activación de cada uno de dichos reactivos que son reactivos, estando relacionada la cantidad de la misma con la cantidad de cada uno de dichos diferentes analitos en dicho medio. 2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho segundo miembro sbp puede unirse con dicho analito. 3. Método según la reivindicación 1, en el que al menos uno de dichos reactivos que son reactivos comprende un aceptor de energía fluorescente. 4. Método según la reivindicación 1, en el que al menos uno de dichos reactivos que son reactivos es un precursor de indicador fotoactivo que se activa mediante oxígeno singlete para formar un indicador fotoactivo. 5. Método según la reivindicación 1, en el que dicha activación diferencialmente comprende irradiar dicho medio con luz de diferentes longitudes de onda. 6. Método según la reivindicación 1, en el que al menos uno de dichos sensibilizadores es un fotosensibilizador. 7. Método según la reivindicación 6, en el que dicho fotosensibilizador es un colorante. 8. Método según la reivindicación 1, en el que al menos uno de dichos reactivos que son reactivos o dichos reactivos sensibilizadores está asociado con una partícula. 9. Método homogéneo según la reivindicación 8 para determinar la presencia o las cantidades relativas de más de dos analitos diferentes que se sospecha que están en un medio, comprendiendo dicho método: a) proporcionar en combinación (1) un medio que se sospecha que contiene dichos más de dos analitos, (2) un fotosensibilizador para cada uno de dichos analitos, estando cada uno de dichos fotosensibilizadores asociado con una primera partícula y generando oxígeno singlete y teniendo una longitud de onda de sensibilización diferente entre sí, y (3) composiciones quimioluminiscentes que pueden activarse mediante oxígeno singlete, asociándose cada uno de éstas con una segunda partícula, en el que dichas composiciones quimioluminiscentes pueden detectarse diferencialmente mediante diferentes longitudes de onda de emisión o mediante diferentes razones de descomposición y en el que las diferentes longitudes de onda de sensibilización y las diferentes longitudes de onda de emisión o diferentes razones de descomposición dan como resultado la detección diferencial de cada uno de dichos analitos y en el que cada uno de dichos fotosensibilizadores está asociado con un primer miembro de par de unión específica (sbp) y en el que, para cada uno de dichos fotosensibilizadores, dicho primer miembro sbp puede unirse a un analito respectivo o a un segundo miembro sbp para formar un complejo relacionado con la cantidad de dicho analito, e b) irradiar diferencialmente cada uno de dichos fotosensibilizadores con luz y detectar la cantidad de luminiscencia generada por cada una de dichas composiciones quimioluminiscentes en un tiempo tras la activación y a una longitud de onda que corresponde a la razón de descomposición y longitud de onda de dicha emisión luminiscente, estando relacionada la cantidad de la misma con la cantidad de cada uno de dichos diferentes analitos en dicho medio. 10. Método según la reivindicación 9, en el que al menos uno de dichos fotosensibilizadores es un colorante. 34   11. Método según la reivindicación 9, en el que al menos uno de dichos fotosensibilizadores se selecciona del grupo que consiste en naftocianinas, ftalocianinas, tiazinas, porfirinas, metaloporfirinas, oxazinas, cianinas, escuaraínas, xantenos, merocianinas. 12.Método según la reivindicación 9, en el que al menos una de dichas composiciones quimioluminiscentes es un compuesto olefínico. 13. Método según la reivindicación 12, en el que dicho compuesto olefínico se selecciona del grupo que consiste en tioxenos, dihidrooxazinas y dioxenos. 14. Método según la reivindicación 9, en el que dichas partículas primera y segunda se seleccionan independientemente del grupo que consiste en partículas de látex, liposomas y gotitas de aceite. 15. Método según la reivindicación 9, en el que dichos analitos se seleccionan del grupo que consiste en ligandos, receptores y polinucleótidos.   36   37   38   39