CONJUNTO DE CEBADORES, SONDAS, PROCEDIMIENTO Y KIT PARA LA DETECCION Y CUANTIFICACION DE SECUENCIAS DE ADN ESPECIFICAS DE BRUCELLA SPP.

Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para la detección y cuantificación de secuencias de ADN específicas de Brucella spp.

La presente invención se refiere a un conjunto de cebadores, sonda, procedimiento y kit de diagnóstico molecular de Brucella spp., y más concretamente para la detección de ADN específico de gérmenes del género Brucella en muestras clínicas basada en la amplificación y cuantificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. La técnica es mucho más sensible que la PCR convencional, la PCR-ELISA (PCR acoplada a un enzimoinmunoensayo), los métodos bacteriológicos, y más específica que los métodos serolóqicos habituales, permitiendo su utilización para la puesta en práctica de un procedimiento fácil y rápido de diagnóstico molecular de la infección por Brucella spp. en suero sanguíneo y en otras muestras clínicas

Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para la detección y cuantificación de secuencias de ADN específicas de Brucella spp..

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un conjunto de cebadores, sonda, procedimiento y kit de diagnóstico molecular de Brucella spp., y más concretamente para la detección de ADN específico de gérmenes del género Brucella en muestras clínicas basada en la amplificación y cuantificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real.

Estado de la técnica

La brucelosis es una zoonosis de distribución mundial que provoca una alta morbilidad en humanos. La enfermedad es endémica en amplias zonas del planeta. Los gérmenes del género Brucella son capaces de sobrevivir e incluso multiplicarse dentro de las células del sistema mononuclear fagocítico lo cual explica la marcada tendencia de la enfermedad a producir complicaciones e incluso recaídas una vez concluido el tratamiento. Algunas de las complicaciones de la brucelosis son muy graves pudiendo conducir a la muerte del paciente. Se ha demostrado que la aparición de complicaciones se relaciona significativamente con una demora en el diagnóstico de la infección [Colmenero J.D. et al., 1996, Medicine (Baltimore), 75: 195-211].

Debido a lo heterogéneo y escasamente específico de su cuadro clínico, actualmente el diagnóstico de la brucelosis requiere siempre una confirmación mediante el aislamiento del germen, o la detección de anticuerpos específicos mediante diferentes pruebas serológicas. Ambos métodos poseen importantes limitaciones. De los métodos bacteriológicos, el hemocultivo es la muestra clínica más rentable para el diagnóstico microbiológico. Su sensibilidad oscila entre el 53-90% en los casos de brucelosis aguda producida por B. melitensis. Sin embargo, esta sensibilidad se reduce considerablemente en los pacientes con cuadros clínicos de larga evolución, en los pacientes con complicaciones focales y en las infecciones causadas por B. abortus y B. suis. Los resultados del hemocultivo son en muchas ocasiones excesivamente lentos. Por otra parte, la manipulación de estos gérmenes supone un alto riesgo para el personal de laboratorio que se ve obligado a operar con cepas vivas para su correcta identificación final, debido a que Brucella spp. es un patógeno de clase III.

Aunque en la actualidad existe una amplia batería de métodos serológicos aplicables al diagnóstico de la brucelosis humana, todos ellos adolecen de importantes limitaciones. Así, su sensibilidad es baja en las fases precoces de la enfermedad, en la cual los niveles de anticuerpos aún pueden ser bajos. Además su especificidad es escasa en zonas de alta endemia, en personas profesionalmente expuestas, en pacientes que han padecido una infección reciente y en las frecuentes recidivas de la enfermedad.

Se ha demostrado que la amplificación de secuencias específicas de ADN de Brucella mediante PCR es un procedimiento mucho más sensible que los hemocultivos, y que su positividad es una prueba bastante específica de enfermedad activa (ES 2137124). Gracias a este método, la detección del germen, y por tanto de la enfermedad, puede realizarse de forma rápida y fácil, independientemente del tiempo de evolución de la infección y de la respuesta serológica que pueda producirse en el paciente. Este método también permite la monitorización del tratamiento y el diagnóstico precoz de las recidivas.

Estas técnicas de amplificación del ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permiten la amplificación exponencial e identificación de un fragmento especifico de ADN y se han mostrado muy útiles en el diagnóstico de diversas enfermedades infecciosas producidas por gérmenes de dificil aislamiento con las técnicas bacteriológicas convencionales. Los gérmenes del género Brucella crecen lentamente y requieren ocasionalmente medios y condiciones especiales. En base a los conocimientos disponibles sobre la biología molecular de los gérmenes del género Brucella, y aplicando las técnicas de amplificación del ADN, se ha descrito una técnica sensible y específica de PCR en muestras de sangre humana (PCR-ELISA), que permite obtener mejores resultados en el diagnóstico que mediante el uso de técnicas de PCR o de técnicas microbiológicas convencionales, tanto de la infección primaria como de las recidivas, así como en las complicaciones de la enfermedad (ES 2220180). Sin embargo, la PCR-ELISA, aunque es capaz de amplificar 10 fg de ADN bacteriano (cantidad equivalente aproximadamente a 2 células bacterianas), requiere la manipulación de los productos PCR una vez completada la amplificación y es obligatoria la detección mediante digoxigenín-ELISA. Además, esta técnica consume excesivo tiempo, no siendo por ello muy adecuada para laboratorios generales de diagnóstico clínico.

Otros autores han propuesto métodos para la detección, identificación y diferenciación de todas las especies de Brucella, incluidas las cepas vacunales, basados en la aplicación de la técnica de PCR convencional, y utilizando 8 parejas diferentes de cebadores (WO 2006/097347). Los métodos referidos requieren, para la detección de las diferentes especies de Brucella, la realización de un cultivo previo a partir de aislados procedentes de sangre u otros fluidos, tanto de origen humano como animal, y no directamente desde el suero sanguíneo u otras muestras clínicas, antes de la extracción del ADN bacteriano y de la posterior detección por PCR. El hecho de tener que realizar dicho cultivo incrementa el tiempo necesario para el diagnóstico y, lo más importante, representa un riesgo para el personal de laboratorio que maneja los microorganismos, al ser Brucella un patógeno de clase III.

Con el objetivo principal de evitar estas dificultades, la presente invención se refiere a una técnica de PCR cuantitativa en tiempo real optimizada y evaluada conforme a su uso diagnóstico en muestras de suero obtenido a partir de sangre periférica y en otras muestras, clínicas (LCR, orina, pus, etc.) de pacientes con brucelosis. La presente invención comprende cebadores diferentes a los especificados en las patentes ES 2137124 y ES 2220180, en las que figuran los mismos inventores que en la presente. Dichos cebadores, aunque corresponden a secuencias de ADN que codifican para la misma proteína de membrana BCSP31 que los especificados en la presente invención, amplifican una región termodinámicamente inestable, imposibilitando el diseño de una sonda de hidrólisis (tipo TaqMan) compatible. Además, el producto amplificado usando los mismos puede dificultar, por su gran tamaño, la detección y cuantificación mediante PCR a tiempo real.

En los últimos años otros autores han desarrollado aplicaciones de la PCR a tiempo real para la detección ADN de Brucella spp. en muestras sanguíneas de pacientes con brucelosis. Debeaumont y colaboradores utilizaron la tecnología LightCycler para la amplificación mediante PCR a tiempo real (LC-PCR) en muestras de suero de un fragmento de 169 pb de la proteína BCSP31, presente en todas las especies y biovariedades de Brucella, usando cebadores distintos a los especificados en la presente invención, así como sondas FRET (Debeaumont C. et al., 2005, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 24: 842-845). La sensibilidad del método propuesto por estos autores fue de 18 fg de ADN, lo que equivale a 6 células bacterianas, significativamente inferior a los 10 fg (3 células bacterianas) que permite detectar la presente invención. Por otra parte, las sondas FRET son más complejas y su síntesis es más costosa económicamente respecto de las sondas de hidrólisis (también denominadas genéricamente sondas TaqMan) como la comprendida en la presente invención.

Del mismo modo, Navarro y colaboradores, utilizaron la tecnología LC-PCR para amplificar un fragmento de 251 pb de la secuencia de inserción IS711 en muestras de sangre total en lugar de suero (Navarro E. et al., 2006, Clin. Infect. Dis., 42: 1266-1273). En este caso la sensibilidad de los cebadores y la sonda TaqMan empleada fue de 15 fg (5 células bacterianas). El método propuesto por estos autores no comprende la negativización de la PCR, lo que interfiere notablemente a la hora de establecer un valor de cut-off durante la cuantificación de la carga bacteriana. Además, el hecho de utilizar sangre total aumenta el riesgo de aparición de falsos negativos debido a una mayor presencia de inhibidores de la PCR en este tipo de muestras.