NUEVO OLIGONUCLEÓTIDO MARCADO.

Oligonucleótido marcado que comprende un primer segmento nucleotídico,

un segundo segmento nucleotídico, complementario de una secuencia diana, y un tercer segmento nucleotídico, complementario de dicho primer segmento nucleotídico, caracterizado porque comprende un fluoróforo, un extintor y al menos un nucleósido de anomería alfa

La presente invención se refiere a un nuevo oligonucleótido marcado. La invención también se refiere a un procedimiento que emplea dicho oligonucleótido.

A menudo es necesario, en las tecnologías relativas a los ácidos nucleicos y al material genético, determinar si un gen, una parte de un gen o una secuencia nucleotídica está presente en un organismo vivo, un extracto celular de este organismo o cualquier otra muestra biológica.

En la bibliografía se describen diferentes tipos de métodos de detección de ácidos nucleicos. Estos métodos, y particularmente aquellos que requieren la detección de polinucleótidos, se basan en las propiedades de emparejamiento de las cadenas complementarias de ácidos nucleicos, denominado habitualmente “hibridación de ácidos nucleicos” o simplemente “hibridación”.

De manera general, después de identificar la secuencia específica de un organismo o de una enfermedad que debe ser analizada, es conveniente extraer los ácidos nucleicos de una muestra, amplificar y detectar la secuencia de interés. Numerosos métodos de amplificación y de detección se han desarrollado con este fin.

De este modo, la PCR (Polymerase Chain Reaction [reacción en cadena de la polimerasa]) se basa en la repetición de un proceso en tres etapas: desnaturalización del ADN de cadena doble, la hibridación de los cebadores con el ADN de cadena sencilla, y la extensión enzimática de los cebadores por una ADN polimerasa termoestable que sintetiza una cadena de ADN complementario al que sirve de diana para los cebadores oligonucleotídicos.

La amplificación puede analizarse al final del ciclo (PCR “end point”) o en tiempo real (PCR en tiempo real) gracias a la utilización de un marcado fluorescente del producto amplificado. Existen varias técnicas de PCR en tiempo real. Una de ellas emplea sondas particulares denominadas “molecular beacons”, que son secuencias en horquilla (o “hairpin”) que comprenden una estructura en bucle “loop”, una varilla “stem” que contiene un fluoróforo en un extremo de la secuencia y un extintor de fluorescencia (o “quencher“) en el otro extremo (Tyagi, S. y Kramer, FD., Nat. Biotechnol., 1996, 14, 303-308, Marras, SA. et al, Genet Anal., 1999, 14, 151-156). Por debajo de la temperatura de hibridación, estas secuencias, no hibridadas con una secuencia diana, adoptan una configuración llamada en “horquilla”: los extremos 5' y 3' están próximos, no hay emisión de fluorescencia. Cuando la sonda mediante la secuencia del bucle (loop) reconoce a, e hibrida con, un amplicón, que corresponde a la secuencia diana amplificada, la estructura de la varilla (stem) se desestabiliza, los extremos se alejan, el “quencher” ya no desempeña su papel y se produce emisión de fluorescencia.

Los documentos US-A5.866.336 y US-A-6.117.635, de los mismos inventores, proponen también sondas llamadas “molecular beacons”, también llamadas balizas moleculares, pero en una configuración particular. De este modo, el extremo 3' de la sonda se prolonga en forma de un cebador de amplificación. Este último, una vez hibridado con su diana complementaria, permite por elongación, y eventualmente con ayuda de un cebador de amplificación adaptado, la amplificación de la diana.

Sin embargo, esta configuración obliga a los científicos a encontrar no solamente dos zonas adyacentes para definir el cebador de amplificación (seleccionado en general por su sensibilidad) y la sonda de detección (seleccionada en general por su especificidad). Siendo ya difícil la definición de dichas zonas incluso en ausencia de tensión por proximidad, el desafío es, en este caso, muy arduo incluso en algunos casos imposible.

Sin embargo, en algunas condiciones, la emisión de fluorescencia por sondas “molecular beacons” puede ser “parasitada” por un ruido de fondo debido al alejamiento del fluoróforo y del “quencher” consecuencia de una degradación por nucleasas presentes durante la reacción de amplificación. Éste es particularmente el caso durante una PCR “convencional”, ya que la propia enzima Taq polimerasa posee una actividad 5' nucleasa. Además, aparte de la emisión de fluorescencia “parásita” que aparece durante una PCR en tiempo real, la escisión de las “molecular beacons” debido a la presencia de enzima termoestable polimerasa al final del ciclo afecta a un análisis de gradiente de temperatura posterior (“end point”) a la amplificación. Ahora bien, este análisis de gradiente de temperatura posterior a la amplificación es el método más sensible para detectar variaciones simples de las secuencias, como los SNP (“single nucleotide polymorphisme”, o polimorfismo de un solo nucleótido) mediante las “molecular beacons”.

La NASBA es otra tecnología de amplificación, isotérmica, de ácido nucleico que se basa en la acción conjunta de tres enzimas (transcriptasa inversa AMV, ARNasa-H y ARN T7 polimerasa). La amplificación puede analizarse al final del ciclo (NASBA “end point”) o en tiempo real (NASBA en tiempo real) gracias a la utilización de un marcado fluorescente del producto amplificado, mediante la utilización de sondas “molecular beacons”. Sin embargo, en “end point”, la presencia de ARNasa H, enzima indispensable durante el inicio de la NASBA, puede inducir, al final de la reacción, una degradación del ARN diana híbrido con la “molecular beacon”. Se observa entonces una disminución de la señal de fluorescencia que se debe a la escisión del ARN diana. Un análisis de gradiente de temperatura posterior a la amplificación es, por lo tanto, delicado.

Ya sea en PCR o en NASBA, la emisión de fluorescencia también puede ser parasitada por la hibridación no específica de la parte de la varilla de la “molecular beacon” con el amplicón. Es importante entonces reducir esta hibridación parásita.

Finalmente, las “molecular beacons” también pueden utilizarse para la detección de secuencias diana independientemente de una amplificación. En efecto, es posible analizar la expresión de un gen en células vivas mediante la inyección de “molecular beacons”, reflejando la fluorescencia emitida la hibridación de la sonda con un transcrito diana. Sin embargo, la presencia de numerosas nucleasas activas en la célula implica una fuerte degradación de las sondas, y por lo tanto induce la emisión de fluorescencia que no se debe a la hibridación de la sonda con una secuencia diana.

Es importante, por lo tanto, mejorar las técnicas de amplificación actuales para hacerlas más sensibles, disminuyendo particularmente los fenómenos de escisión no específicos de las “molecular beacons” del estado de la técnica.

La presente invención se propone resolver el conjunto de los inconvenientes del estado de la técnica presentando nuevos oligonucleótidos marcados específicos, estables y resistentes a las nucleasas.

En este sentido, la invención se refiere a un oligonucleótido marcado que comprende un primer segmento nucleotídico, un segundo segmento nucleotídico, complementario de una secuencia diana, y un tercer segmento nucleotídico, complementario de dicho primer segmento nucleotídico, caracterizado porque comprende un fluoróforo, un extintor y al menos un nucleósido de anomería alfa.

Preferentemente, dichos primer y tercer segmentos están a uno y otro lado del segundo segmento.

Preferentemente, dicho segundo segmento está constituido por nucleótidos de anomería alfa.

Preferentemente, el oligonucleótido marcado de acuerdo con la invención se caracteriza porque el fluoróforo está en un extremo de dicho oligonucleótido y el extintor está en el otro extremo de dicho oligonucleótido.

Preferentemente, dicho fluoróforo es una fluoresceína. Preferentemente, dicho extintor es dabsilo.

Preferentemente, dicho primer segmento comprende de 3 a 8 nucleótidos, dicho segundo segmento comprende de 10 a 35 nucleótidos, y dicho tercer segmento, cuando está presente, comprende de 3 a 8 nucleótidos.

La invención también se refiere a un procedimiento para detectar un material nucleico en una muestra biológica que comprende las siguientes etapas:

a) se extrae el material nucleico de una muestra biológica,

b)... [Seguir leyendo]

1. Oligonucleótido marcado que comprende un primer segmento nucleotídico, un segundo segmento nucleotídico, complementario de una secuencia diana, y un tercer segmento nucleotídico, complementario de dicho primer segmento nucleotídico, caracterizado porque comprende un fluoróforo, un extintor y al menos un nucleósido de anomería alfa.

2. Oligonucleótido marcado de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dichos primer y tercer segmentos están a uno y otro lado del segundo segmento.

3. Oligonucleótido marcado de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicho segundo segmento comprende al menos un nucleósido de anomería alfa.

4. Oligonucleótido marcado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el fluoróforo está en un extremo de dicho oligonucleótido y el extintor está en el otro extremo de dicho oligonucleótido.

5. Oligonucleótido marcado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicho fluoróforo es una fluoresceína.

6. Oligonucleótido marcado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho extintor es dabsilo.

7. Oligonucleótido marcado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicho primer segmento comprende de 3 a 8 nucleótidos, dicho segundo segmento comprende de 10 a 35 nucleótidos, y dicho tercer segmento, cuanto está presente, comprende de 3 a 8 nucleótidos.

8. Procedimiento para detectar un material nucleico en una muestra biológica que comprende las siguientes etapas:

a) se extrae el material nucleico de una muestra biológica,

b) se amplifica el material nucleico para obtener amplicones de al menos una secuencia diana del material nucleico

c) se utiliza, simultáneamente a la etapa b) o posteriormente a la etapa b), al menos un oligonucleótido marcado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7

d) se detecta la presencia de dichos amplicones.